茄褐紋病菌的生物學特性及其防治藥劑室內毒力強度

葉 瑩，曾怡林，虞凡霜，張凱東，強 遙，蔣軍喜

(江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045)

0 引言

【研究意義】茄子褐紋病是國內外茄子生產上的一種重要病害[1]，近年來在江西省南昌市普遍發生，給當地茄子生產造成嚴重經濟損失。【前人研究進展】該病由半知菌類真菌茄褐紋擬莖點霉(Phomopsisvexans)，有性世代為子囊菌門間座殼屬茄褐紋間座殼(Diaporthevexans)侵染所致[2]，主要危害茄子葉片、枝干和果實，常引起葉斑、枝枯和果腐等癥狀，以果腐損失最大[3-4]。自1892年HALSTED報道茄子褐紋病后，世界各地茄子栽培地區均有該病的研究報道，國內外學者關于茄子褐紋病的研究主要集中在病原菌鑒定、致病機制、抗性遺傳及抗病品種篩選等方面[5-9]。目前，僅有吳仁鋒等[10]對武漢地區茄褐紋病菌的培養性狀進行相關研究，而對于茄子褐紋病菌的藥劑篩選僅有湖南、山東及安徽等地開展室內毒力測定。【研究切入點】與其他地區相比，南昌市茄褐紋病的研究還不夠深入和系統，有關病原菌生物學特性和藥劑篩選方面的報道還很少見。【擬解決的關鍵問題】鑒于此，開展南昌地區茄褐紋病菌生物學特性及其防治藥劑室內毒力研究，以期為該病的藥劑防治提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株H1由江西農業大學植物病理學實驗室于2020年7月從南昌市郊茄褐紋病病葉中分離所得，經形態學和分子生物學鑒定確定為茄褐紋病菌(Phomopsisvexans)，并經致病性測定為強致病力菌株。該菌株用瓊脂培養基(PCA)斜面保存于4℃冰箱，試驗前在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)平板上活化。

1.1.2 培養基 試驗共選取8種培養基作為供試培養基，即茄葉煎汁培養基、PDA、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PSA)、燕麥片培養基(OMA)、玉米片培養基(CMA)、胡蘿卜培養基(CA)、水瓊脂培養基(WA)和查氏培養基(Czapek)，各培養基參照文獻[11]的方法配制。

1.1.3 藥劑 供試藥劑共8種，具體信息見表1。

表1 8種供試藥劑的基本情況Table 1 Eight fungicides used in the experiment

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

1) 病原菌生物學特性測定。采用單因素試驗設計設置不同溫度、pH、光照條件、培養基、碳源和氮源等培養條件，測定茄褐紋病菌在不同條件下的生長狀況，以篩選其最適生長條件。在PDA平板上培養3 d的菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，將菌餅接種在平板培養基的中央，按設置的不同條件培養，3次重復。試驗條件：溫度，將菌餅接種于PDA平板中央，分別放置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的恒溫培養箱中黑暗培養；pH，將菌餅接種在用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調配的pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13的PDA平板上，25℃全黑暗培養[12-13]；光照條件，將接種的PDA平板分別置于24 h黑暗、12 h光暗交替和24 h光照條件下25℃培養[14]；培養基，將菌餅分別接種于PDA、PSA、OMA、CMA、CA、WA、Czapek和茄葉煎汁培養基共8種培養基上，25℃全黑暗培養；碳源，以Czapek培養基為基礎培養基，用葡萄糖、纖維二糖、α-乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇和可溶性淀粉取代Czapek培養基中的蔗糖，配置成8種不同的碳源培養基[15]，將菌餅分別接種于8種不同碳源的培養基上25℃全黑暗培養；氮源，以Czapek培養基為基礎培養基，用硝酸鉀、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸銨和氯化銨取代Czapek培養基中的硝酸鈉，配置成8種不同的氮源培養基[15]，將菌餅分別接種于8種不同的氮源培養基上25℃全黑暗培養。

2) 病原菌室內毒力測定。采用菌絲生長速率法[16]測定8種藥劑對菌株H1的毒力，在預實驗的基礎上，先將各藥劑按其有效成分分別稀釋為9個質量濃度梯度。各藥劑分別與PDA培養基按1∶9混合均勻后倒入滅菌的培養皿中，制成濃度為1×103μg/mL、2.5×102μg/mL、6.3×101μg/mL、1.6×101μg/mL、3.9×100μg/mL、1×100μg/mL、2.4×10-1μg/mL、6.1×10-2μg/mL和1.5×10-2μg/mL的含藥平板，同時以等量的無菌水代替藥液制作對照平板。將直徑5 mm的適齡菌餅接種于不同濃度梯度的含藥和對照平板中央，3次重復，25℃恒溫培養箱中黑暗培養。

1.2.2 指標測定 接種培養6 d后，采用“十字交叉法”[12]測量菌落直徑，計算菌絲生長速率并根據菌絲生長速率大小判斷生長條件優劣；以藥劑濃度的對數為自變量(x)，相對抑制率的概率值為因變量(y)，擬合8種殺菌劑對茄褐紋擬莖點霉的獨立回歸方程，計算各藥劑的抑菌率、抑制中質量濃度(EC50)及相關系數(R)，根據EC50判斷各藥劑的毒力大小，即藥劑的EC50越小，其對病原菌毒力越強[17]。

菌絲生長速率=(菌落生長直徑-菌餅直徑)/菌落培養天數

抑菌率=(對照組凈菌落直徑-處理組凈菌落直徑)/對照組凈菌落直徑×100%

1.3 數據處理與分析

利用SPSS 22和Excel 2010對數據進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌生物學特性研究

從圖1看出，病原菌P.vexans在不同溫度、pH、光照條件、培養基、碳源和氮源等培養條件下生長速率存在差異。

2.1.1 溫度 病原菌P.vexans在10～30℃條件下均能生長，隨著溫度升高菌絲生長速度呈先升后降趨勢，生長速率依次為 25℃>20℃>30℃>15℃>35℃>10℃>5℃。各處理間均存在顯著差異，其中，5℃停止生長，≥35℃幾乎不生長，25℃時菌絲生長最快，生長速率達11.06 mm/d。表明，該菌的最適生長溫度為25℃。

2.1.2 pH 病原菌P.vexans在pH為3～12時均能生長，隨著pH增大菌絲生長速度呈先升后降趨勢，生長速率依次為6>5>4=7>8>9>10>3>11>12>13。其中，pH 13時停止生長，pH 4～7時適宜病菌生長，pH 6時菌絲生長最快，達12.50 mm/d，顯著高于其余處理，pH 4和pH 7時病菌的生長速率相等。表明，病原菌P.vexans生長最適pH為6，喜偏酸性環境。

2.1.3 光照條件 病原菌P.vexans在連續黑暗、光暗交替和連續光照3種光照條件下均能生長，其生長速率分別為11.00 mm/d、10.92 mm/d和9.36 mm/d，各處理間均存在顯著差異，其中，在連續黑暗條件下生長速率最快，顯著高于其余2個處理，光暗交替下的生長速率顯著高于連續光照。表明，黑暗條件更有利于病原菌P.vexans的菌絲生長。

2.1.4 培養基 病原菌P.vexans在8種不同培養基上均能生長，生長速率為5.06～12.36 mm/d，依次為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基>馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基>胡蘿卜培養基>燕麥片培養基>玉米片培養基>茄葉煎汁培養基>查氏培養基>水瓊脂培養基，各處理間均存在差異。病原菌在PSA培養基上生長速率最快，菌絲發達，生長速率達12.36 mm/d，其次為PDA、CA、OMA、CMA和茄葉煎汁培養基，生長速率分別為11.63 mm/d、11.08 mm/d、10.44 mm/d、9.44 mm/d和8.25 mm/d，在Czapek培養基和WA培養基上生長速率最緩慢，且菌絲極不發達，不適合該病原菌生長。

注：不同大小寫字母分別表示差異達極顯著(P<0.01)和顯著水平(P<0.05)。Note：Different capital and lowercase letters indicate significance of difference at P<0.01 and P<0.05 level.圖1 不同溫度、pH、光照條件、培養基、碳源和氮源處理病原菌菌絲的生長速率Fig.1 Growth rate of pathogen mycelium treated with different temperature, pH, light condition, culture media, carbon source and nitrogen source

2.1.5 碳源 病原菌P.vexan在8種供試碳源培養基上均能生長，生長速率為5.86～9.00 mm/d，依次為麥芽糖>可溶性淀粉>葡萄糖>纖維二糖>α-乳糖>查氏>甘露醇，各處理間存在顯著差異。其中，在以麥芽糖為碳源的平板上生長最快，菌絲生長速率達9.00 mm/d，極顯著高于其余處理；其次是可溶性淀粉和葡萄糖，分別為7.55 mm/d和7.50 mm/d，二者差異不顯著，但均極顯著高于其余處理；在以甘露醇為碳源的平板上生長最慢，其菌絲生長速率僅為5.86 mm/d，顯著低于其余處理。表明，麥芽糖為病原菌P.vexan最適生長碳源。

2.1.6 氮源 病原菌P.vexan在8種供試氮源培養基上均能生長，生長速率為5.19～8.03 mm/d，依次為蛋白胨>氯化銨>酵母膏>查氏>牛肉膏>磷酸二氫銨>硝酸鉀>硝酸銨，處理間存在顯著或極顯著差異。其中，蛋白胨平板上菌絲生長最快，生長速率達8.03 mm/d，極顯著高于其余處理；其次是氯化銨和酵母膏，分別為6.83 mm/d和6.64 mm/d，二者差異不顯著，但均極顯著高于除查氏外的其余處理；氯化銨為氮源的菌絲生長速率顯著高于查氏；硝酸銨平板上菌絲生長最慢，生長速率僅為5.19 mm/d。表明，蛋白胨為病原菌P.vexan最適生長氮源。

2.2 8種殺菌劑對病原菌的室內毒力

2.2.1 毒力回歸方程 從表2看出，通過擬合得到8種殺菌劑對茄褐紋病病原菌P.vexan的毒力回歸方程：y40%氟硅唑=0.381x+1.719(R=0.944)，y15%三唑酮=0.328x+0.500(R=0.993)，y70%丙森鋅=0.586x+0.996(R=0.938)，y50%戊唑醇·25%嘧菌酯=1.268x+1.445(R=0.915)，y70%甲基硫菌靈=1.283x+1.146(R=0.934)，y43%戊唑醇=1.769x+1.463(R=0.977)，y50%異菌脲=1.281x+0.791(R=0.949)，y40%嘧霉胺=1.265x-1.144(R=0.926)，相關系數R均>0.9，表明，各藥劑濃度與抑制率間存在良好的線性關系。

表2 8種殺菌劑對茄褐紋病菌的室內毒力強度Table 2 Indoor virulence intensity of eight fungicides against P. vexans

2.2.2 毒力強度 從表5看出，各藥劑的EC50為0.012～8.013 μg/mL，依次為40%氟硅唑<15%三唑酮<70%丙森鋅<50%戊唑醇·25%嘧菌酯<70%甲基硫菌靈<43%戊唑醇<50%異菌脲<40%嘧霉胺，表明，40%氟硅唑對病原菌的抑制效果最好，EC50為0.012 μg/mL；其次是15%三唑酮、70%丙森鋅和50%戊唑醇·25%嘧菌酯，EC50分別為0.02 μg/mL、0.03 μg/mL和0.072 μg/mL，均<0.10 μg/mL；40%嘧霉胺抑制效果相對最差，EC50為8.013 μg/mL。

3 討論

吳仁鋒等[10]研究武漢市茄褐紋病菌生物學特性發現，菌絲生長最適溫度為30℃，最適培養基為PDA，最適pH為6，最適光照條件為24 h全光照，最佳碳源和氮源分別為麥芽糖和硝酸鈉。與該研究結果存在明顯差異，表明，茄褐紋病菌內部存在較明顯的生理分化現象。該生理分化現象是否與茄褐紋病菌致病性有關有待進一步研究。馬珂[18]篩選到咪鮮胺、撲海因和甲基硫菌靈等對安徽和縣茄褐紋病菌毒力較高的藥劑；王姝瑋等[19]篩選到咪鮮胺、甲基硫菌靈和苯醚甲環唑等對湖南新化茄褐紋病菌表現高效的藥劑；李艷青等[20]研究表明，多菌靈對山東壽光茄褐紋病菌具有強毒力。由于藥劑在田間的實際防效受寄主、病原和環境條件等特性及相互關系的影響，因此，該研究篩選出的氟硅唑、三唑酮、丙森鋅、戊唑醇·嘧菌酯、甲基硫菌靈、戊唑醇和異菌脲等7種殺菌劑對南昌市茄褐紋病菌的防效還有待進一步的田間藥效試驗進行驗證，以確定真正有效的藥劑種類和使用濃度。

4 結論

研究結果表明，該菌生長最適溫度為25℃，最適pH為6，全黑暗條件下菌絲生長速率最快，最適培養基為PSA，最佳碳源和氮源分別為麥芽糖和蛋白胨。氟硅唑、三唑酮、丙森鋅、戊唑醇·嘧菌酯、甲基硫菌靈、戊唑醇和異菌脲7種殺菌劑對南昌市茄褐紋病菌均具有強毒力，嘧霉胺的毒力則較弱，可推薦前7種殺菌劑在當地生產上防控茄褐紋病使用。該研究為茄褐紋病發病規律研究奠定了一定的基礎，同時，上述藥劑可為今后開展田間藥效試驗提供參考。