粵紫萁離體再生技術研究

陳朋 楊蕾蕾 彭楊 張蘇州 徐桂紅 楊建芬 張壽洲

摘要：粵紫萁（Osmunda mildei）為新近形成的自然雜交種，其分布區狹窄、種群個體數量少、有性繁殖能力極低。該文以孢子為外植體， 以MS、3/4MS、1/2MS和1/4MS為基本培養基，探討不同生長調節劑對粵紫萁孢子萌發、原葉體增殖和孢子體形成的影響。結果表明：粵紫萁孢子中極少的可育孢子在植物生長調節劑的作用下，能夠萌發并發育形成原葉體;原葉體生長及增殖的最適組合為1/2MS +1.0 mg·L1 6BA+0.05 mg·L1 NAA和1/2MS +1.0 mg·L1 6BA+0.5 mg·L1 IBA;在1/4MS基本培養基中，原葉體增殖的同時生長發育完善，形成正常的幼孢子體，形成率達83.49%;孢子體最佳生根配方為MS+0.5 mg·L1 IBA;組培苗在河沙∶黃土∶腐殖質=1∶1∶3的栽培基質中成活率在98%以上，且生長旺盛。綜上結果，該研究為粵紫萁的人工繁育及其資源保護以及其他瀕危蕨類植物的人工保育提供了參考。

關鍵詞： 粵紫萁， 孢子， 原葉體， 孢子體， 雜交種

中圖分類號：Q813.1

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2021）02030107

Abstract：Osmunda mildea is a recently formed natural hybrid species with a narrow distribution area. The number of the population is very small， and its sexual reproduction is extremely low.Using spores as explants， we investigated the effects of basic media （MS， 3/4 MS， 1/2 MS and 1/4 MS） and different plant growth regulators （PGRs） on spores germination， prothallium proliferation and sporophyte formation. The results were as follows： Extremely few fertile spores of O. mildea could germinate and develop into prothallus in effect of plant growth regulators; The optimal PGRs combinations of prothallus growth and proliferation were 1/2MS +1.0 mg·L1 6BA+0.05 mg·L1 NAA and 1/2MS +1.0 mg·L1 6BA+

0.5 mg·L1 IBA; In the 1/4MS with no PGR medium， prothallus were well developed with the proliferation， and the young sporophyte seedling formatted， the formation of scale was 83.49%; The best rooting PGR concentration for young sporophyte was MS+0.5 mg·L1 IBA; In loess∶river sand∶humus=1∶1∶3 cultivation matrix was the best， the survival rate was more than 98%， and the seedlings thrived. This study is great significance to the artificial breeding and conservation of O. mildea， and also provides reference to the artificial conservation of other endangered fern species.

Key words： Osmunda mildei， spore， prothallus， sporophyte， hybrid species

粵紫萁（Osmunda mildei）為紫萁科（Osmundaceae）紫萁屬（Osmunda）植物，分布范圍極其狹窄，最早僅在香港發現有分布（秦仁昌，1959;李添進等，2003），后多年在野外難覓其蹤影。20世紀90年代末，陸續在廣東省深圳市東部的筆架山、七娘山和田心山，江西省崇義縣和湖南省通道縣發現有粵紫萁分布（蔣日紅等，2010;嚴岳鴻等，2011），雖然粵紫萁在多地被重新發現，但野外記錄數量極少，到目前為止僅十多株。粵紫萁體細胞染色體核型的研究發現其具有明顯的雜種特性（張壽洲等，2008），孢子母細胞減數分裂構型研究（何子燦等，2006）也證實了該種可能為屬內組間遠緣雜交種，基于rbcL 和trnLrnF序列構建的系統發育樹支持粵紫萁是以華南紫萁（O. vachellii）為母本、紫萁（O. japonica）為父本的雜交種（勾彩云等，2008）。粵紫萁為種間雜交種在Tsutsumi et al.（2012）的研究中進一步得到確證。

自然雜交是物種自然演化過程中非常重要的一部分。在生態系統中，自然雜交通過影響遺傳多樣性和物種多樣性進而影響生態系統的穩定性和可恢復性（商輝和嚴岳鴻，2017）。盡管目前針對自然雜交對于物種演化的影響與意義已有大量的研究，但對于親緣關系較遠的不同物種間的自然遠緣雜交發生條件及擴散機理缺少足夠的認識。作為異域多地獨立發生的自然雜交種（王瑩等，2015），粵紫萁為研究自然遠緣雜交形成機理與演化提供了重要的研究材料。自然條件下，由于粵紫萁僅產生極少的可育孢子，通過孢子自然繁殖非常困難，因此粵紫萁野外數量極少（商輝和嚴岳鴻，2017）。植物組織培養為瀕危物種的保育及深入研究提供了重要的途徑，本研究以粵紫萁孢子為外植體，通過不同基本培養基及生長調節劑種類與濃度配比摸索，成功建立了孢子萌發、原葉體增殖及生根培養的完善組培再生體系。本研究不僅為遠緣自然雜交機理的深入研究提供重要的技術保障，而且也為其他瀕危蕨類植物的人工保育提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

外植體采自栽種在深圳市中科院仙湖植物園遷地保護的一株粵紫萁（圖1：F）。3—5月粵紫萁孢子開始形成，待孢子葉完全展開，孢子囊開始由深綠色向淡綠轉變時，將孢子葉摘下，帶回實驗室預處理。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒采集回來的孢子葉立即用清水沖去表面浮塵，待孢子葉表面的水分晾干后，置于鋪有硫酸紙的培養皿中，放在干燥器中干燥處理12～24 h。第2天收集硫酸紙上的孢子，在超凈工作臺上，先將其放入小試管中，無菌水浸泡5～10 min，然后用低速離心機3 000 g離心后倒去上清液，再加入0.1%的HgCl2溶液浸泡2～6 min，無菌水沖洗6次，最后加適量無菌水混勻制成懸浮液，每吸管吸取約200 μL懸浮液接種于不同的培養基中。

1.2.2 原葉體的獲得以1/2MS為基本培養基，按6芐氨基腺嘌呤（6BA， 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）mg·L1和萘乙酸（NAA， 0.05）mg·L1設置5個培養基的植物生長調節劑組合和不添加植物生長調節劑的1/2MS為基本培養基作為空白對照，接種后觀察孢子萌發情況，以肉眼可清晰看到綠色為啟動開始時間。

1.2.3 原葉體的繼代增殖培養植物生長調節劑對原葉體繼代增殖的影響：以MS為基本培養基，設置6BA（0.5、1.0、1.5、2.0）mg·L1與NAA（0.05、0.50）mg·L1 8個培養基組合（表1），研究6BA和NAA對原葉體繼代增殖的影響。

無機鹽濃度對原葉體繼代增殖的影響：設置MS、3/4MS、1/2MS和1/4MS 4種基本培養基配方（表2，配方中只改變MS基本培養基配方的大量元素濃度分別為原來的1、3/4、1/2和1/4），進行繼代增殖培養試驗。

增殖原葉體量=培養后原葉體重量-接種原葉體重量;增殖率（%）=增殖原葉體重量/接種原葉體重量×100。

以上試驗每瓶均接入2 cm2左右的原葉體團5個，每組處理接種10瓶，重復5次，45 d左右統計結果。

1.2.4 原葉體中幼孢子體的形成設置MS、3/4MS、1/2MS和1/4MS 4種基本培養基配方（表3），以瓶為統計單位，每個培養基接種50瓶，每瓶接種5個2 cm2左右的原葉體團;為了有利于幼孢子體的形成，接種的同時在固體培養基表面，添加高約1 mm的無菌水。接種后分別于35、45、55、65 d時隨機取出10瓶，統計幼孢子體的形成情況。重復5次，幼孢子體觀察與統計以肉眼清楚可見幼葉為準。幼孢子體數每10瓶為1個統計單位。

成形率（%）=（1瓶培養基中具3片及以上幼葉的單苗棵數/總苗數）×100。

1.2.5 生根培養以MS為基本培養基分別設置吲哚丁酸（IBA， 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg·L1 和NAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg·L1 共10個配方（表4），將原葉體中成形的幼孢子體轉入生根培養基中進行生根培養，45 d后進行統計。試驗重復5次。

以上各試驗的培養基中均加入30 g·L1蔗糖、6.5 g·L1瓊脂，pH 5.8～6.0，培養室的培養溫度為（25 ± 2）℃，光照時間16 h·d1，光照強度37～40 μmol·m2·s1。

1.3 數據處理

數據采用SPSS 21.0數據統計軟件進行方差分析和多重比較分析（Duncans）。

2結果與分析

2.1 原葉體獲得

粵紫萁孢子經過消毒處理后，接種到不同的萌發培養基中，在相同的培養條件下進行培養。65 d后在6BA濃度低于1.5 mg·L1的培養基中首先觀察到有綠色點狀物出現（圖1：A），繼續培養發現原葉體在生長的同時開始增殖，并彼此相連成簇狀（圖1：B， C），幾乎沒有單個原葉體;75 d后才陸續在6BA濃度高于1.5 mg·L1以上的培養基中，觀察到有綠色點狀物出現，繼續培養原葉體長大并在中脈部分增厚，很難見原葉體增殖。未添加植物生長調節劑的1/2MS培養基中始終未見到有綠色點狀物出現。

2.2 原葉體的增殖培養

2.2.1 植物生長調節劑對原葉體增殖的影響

將成簇狀的原葉體分開后轉接入增殖培養基中培養，觀察到6BA與NAA的不同濃度組合，對粵紫萁原葉體繼代增殖影響的效果差異顯著。當6BA濃度為0.5～1.0 mg·L1時，與NAA組合有利于原葉體的增殖;當6BA濃度大于1.5 mg·L1時，與NAA組合既不利于原葉體增殖，還使原葉體的生長狀態發生了改變，其中脈明顯增厚增大、細胞脆性加大，發生變化的原葉體很難在培養基中繼續增殖。

2.2.2 MS中無機鹽對原葉體增殖的影響不同無機鹽濃度MS培養基對原葉體的生長和增殖影響差異顯著（表2）。在MS培養基中，原葉體的增殖速度最快，整個原葉體團很難用肉眼辨出單個的原葉體;在3/4MS培養基中，原葉體增殖速度沒有在MS培養基中快，可看到原葉體呈密集的長條狀;在1/2MS培養基中的原葉體，增殖速度沒有前兩者快，但是原葉體的體積和表面積明顯增大，團塊邊緣的原葉體因空間足夠，可形成正常的心形;在1/4MS培養基中，原葉體增殖速度最慢，但表面積最大。由此可見，隨著培養基中大量元素的濃度由1/4MS→1/2MS→3/4MS→MS 遞增，原葉體增殖的速度表現為正相關，但在1/4MS和1/2MS培養基中原葉體能夠生長發育完善，而在3/4MS和MS培養中原葉體主要以營養增殖為主。

2.3 孢子體的誘導

試驗表明，培養基中添加了植物生長調節劑的原葉體，只能不斷進行增殖，很難形成孢子體幼苗，必須將原葉體轉移到不添加任何植物生長調節劑的基本培養基中，才能促使原葉體轉化成孢

一周后增加通風時間，20 d以后可以完全去除塑料薄膜。在3種栽培基質中的幼苗均可以成活，成活率均在98%以上，經觀察，栽培基質（2）河沙∶黃土∶腐殖質=1∶1∶3中的幼苗長勢最旺（圖1：E）。

3討論與結論

孢子繁殖是蕨類植物自然狀態下的主要繁殖方式，但蕨類植物的孢子萌發時間各不相同，有一些蕨類植物的孢子還具有休眠期，借助一些外源生長調節劑則可達到打破休眠，誘導萌發的作用（張春萌等，2019）。6BA和NAA是植物組織培養中常用的生長調節劑，NAA屬于植物生長素，而6BA屬于細胞分裂素，二者通常搭配使用。研究表明，6BA和NAA不同濃度的組合可以有效地促進孢子萌發，提高孢子萌發率。在蕨類的配子體生長發育過程中， NAA也能起到促進側向分生組織發育的作用，并且傾向產生雄性配子體（Kosakivska et al.， 2016），進而由雄性配子體向雌雄同體轉變（Somer et al.， 2010）;6BA則是蕨類植物進行組織培養的必要成分，它能夠消除脫落酸（ABA）帶來的負面作用，低濃度也能改變細胞生長、分裂、伸長和分化的速度，較高的濃度能夠誘導根尖分生組織下的根狀體胚胎的形成（Kosakivska et al.， 2016）。本研究通過使用不同濃度6BA與NAA的配比試驗發現，粵紫萁綠色成熟孢子在植物生長調節劑的作用下可以明顯提高萌發率。6BA濃度低于1.5 mg·L1時，粵紫萁孢子的萌發時間縮短，萌發率顯著提高，在后續的增殖培養階段，原葉體能夠持續增殖，但不能形成孢子體幼苗;在6BA（1.5和2.0） mg·L1與NAA 0.05 mg·L1的濃度組合時，萌發率沒有顯著差異;6BA濃度超過2.0 mg·L1時，孢子萌發時間推遲，萌發率也降低。由此推測，生長調節劑對蕨類植物的孢子萌發及增殖具有重要影響，而不同的蕨類植物合適的生長濃度存在一定差異。

除生長調節劑外，MS培養基中大量元素的濃度在蕨類植物孢子體的形成中有重要的影響（Mikua et al.， 2015）。在對Osmunda regalis孢子體形成的試驗中證實，1/8MS是其最佳的培養基（Makowski et al.， 2016）。本研究也發現，1/2MS、1/4MS有利于促進粵紫萁原葉體生長發育，同時配子體授精形成幼孢子體成形率高達78.08%和83.49%，在3/4MS和全量MS中的原葉體在培養初期由于大量營養性增殖而發育不完善，配子體很難通過受精作用而形成孢子體幼苗。粵紫萁孢子體形成試驗中，3/4MS和MS培養基產生的孢子體幼苗，推測應屬于特殊環境下的無配子生殖。粵紫萁屬于雜合二倍體種（何子燦等，2006），通過無配子生殖產生的孢子體幼苗，在第3片葉后很難形成正常葉，其后長出的所有葉片依然與第1片葉相同，具體機理還有待于后續的研究。1/4MS和1/2MS培養基中形成的粵紫萁幼孢子體，有早熟現象，與Yatabe et al.（2011）在人工條件下研究Osmunda × intermedia后代生殖力時，報道其F2有早熟現象的結果相同，其早熟有可能來自特別組合的結果，是一種適應特殊環境的現象。

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（責任編輯周翠鳴）