宏基因組學在奶牛養殖環境中耐藥性研究的應用

張向陽 ， 亢繼俊 ， 張靖菊 ， 劉義明 ， 陳孝杰 ， 李秀波

(中國農業科學院飼料研究所獸醫微生物學實驗室 ， 北京 海淀 100044)

抗生素的發現與使用是人類歷史上一次里程碑式的突破，英國細菌學家弗萊明在實驗室的2次意外發現開啟了抗生素治療感染的新篇章。但是由于不規范使用甚至濫用，藥物殘留和耐藥菌株的廣泛傳播嚴重危害畜牧業健康發展和人類公共衛生安全。近年來，科研人員已經意識到做好耐藥菌的流行病學調查和監測抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)在細菌間水平轉移的重要性[1]。隨著測序技術的飛速發展，借助宏基因組學(Metagenomics)方法使高效快速準確地檢測樣品中耐藥基因及發現新型耐藥基因成為可能。本文將針對宏基因組技術在奶牛養殖中ARGs監測方面的應用進行闡述，以期為了解ARGs借助糞便和空氣等媒介在奶牛間，以及奶牛與環境間傳播擴散的規律提供研究思路。

1 細菌耐藥性研究進展

自1928年弗萊明發現人類第1種抗生素青霉素以來，距今已有90多年的歷史，在此期間又發現了磺胺類(1932年)、氨基糖苷類(1943年)、氯霉素類(1947年)等10多個大類的幾十種抗生素[2]。抗生素成為人類抵抗病原菌感染的利器，徹底改變了現代醫學，挽救了數以億計的生命。數據表明，抗生素仍然是目前最常用的處方藥之一，從2000—2015年，全球抗生素消耗量[衡量的指標為限定日劑量(Defined daily dose，DDD)]增加了約65%，從211億增長到了348億[3]。抗生素在養殖業中的大量使用增加了對動物腸道及環境中攜帶耐藥基因細菌的選擇性壓力。有研究分析，最初的耐藥基因可能是環境中產生抗生素的細菌攜帶，這些耐藥基因從基因層面調控細菌生命活動，發揮不同的生物學功能，如外排泵、水解酶等，用以抗藥自保。為了應對不斷出現的耐藥現狀，科學家研發了第2代、第3代和第4代抗生素，但是相應的耐藥基因甚至在藥物研發階段就被發現了，這些ARGs在不同菌株間隨水平轉移擴散范圍越來越大。多重耐藥菌株甚至超級細菌的相繼出現提醒著我們，人類很可能會面臨無抗生素可用的后抗生素時代。被譽為臨床治療細菌感染“最后一道防線”的兩類藥物——碳青霉烯類和多黏菌素類，也相繼隨著超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)[4]和黏菌素耐藥基因mcr-1[5]的發現，宣告人類臨床抗微生物感染的最后一道防線也即將失去。目前許多的耐藥基因可以隨著質粒在各種細菌間水平傳播，因此做好對多種耐藥基因的監測并及時采取措施，控制耐藥基因隨環境傳播到人類體內的過程，對于保障人類免遭威脅至關重要。

臨床上篩選耐藥基因通常采用細菌培養法，借助多種培養基篩選微生物菌落，通過染色、生化鑒定、16S rRNA等方法進行菌株鑒定，藥敏紙片法、瓊脂稀釋法確定菌株對不同抗生素的敏感性，得到篩選菌株的最低抑菌濃度。借助分離培養的方法鑒定耐藥菌株技術成熟，準確度高，可對分離菌株進一步進行全基因組測序(Whole genome sequencing，WGS)，準確鑒定分離株的血清型及含有的ARGs，并能對菌株進行追根溯源。

目前環境中大部分細菌都無法分離培養，傳統的細菌分離培養法費時費力，完全不能滿足現代化大規模快速檢測的需求[6]。宏基因組學的快速發展，使全面且快速地研究環境樣品中ARGs在不同菌株間的傳播擴散規律成為可能。

2 宏基因組學的發展現狀

宏基因組學的概念最早是在20世紀90年代提出的，指的是通過提取和克隆來自環境樣品中所有微生物的DNA進而對微生物的遺傳物質進行分析，也叫環境基因組學、生態組學等[7]。

隨著測序技術的發展，測序成本大幅降低。第1代Sanger/鳥槍法測序技術存在速度慢、成本高、通量低等方面的不足，使其并不適合廣泛使用[8]。目前，宏基因組學測序分析主要采用的高通量測序技術(High-throughput sequencing)屬于第2代測序技術，優勢是高通量和成本低，比較代表性的有Roche公司的454焦磷酸測序(Pyrosequencing)[9]、Illumina公司的Solexa合成測序[10]和ABI公司的SOLiD連接法測序[11]等。借助這些平臺可對江河湖泊[12-13]、土壤[14]、廢水及排放河流[15-16]、人類和動物腸道糞便[17]等樣本內的ARGs進行測序，探究ARGs在不同環境中的傳播機制及對公共衛生安全的潛在威脅。隨著高通量測序技術的發展，又出現了單分子實時測序的第3代測序技術。Helicos公司的遺傳信息分析系統(Heliscope/Helicos genetic analysis system)[18]、Pacific Bioscience公司的SMRT(Single molecule real-time)技術和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測序技術[19]，標志著第3代測序技術的誕生，第3代測序技術意味著更高的通量，更低的成本和更長的讀取長度[6]。宏基因組學隨著測序技術的發展優勢也越來越明顯，越來越廣泛地被用于研究ARGs在人類、動物和環境中微生物群落間的傳播進化規律，監測ARGs對公共衛生的威脅程度。

宏基因組學的主要流程包括：從環境樣品(糞便、污水等)中提取所有微生物的DNA(包括不可培養細菌)；將提取的基因組DNA片段化后借助載體轉化到宿主菌，構建宏基因組文庫；對文庫進行耐藥性功能篩選，收集抗生素作用下的陽性克隆；對陽性克隆內插入基因擴增后進行高通量測序，對測序所得Reads質控處理并去除宿主序列后進行組裝；對組裝后的序列有兩種分析思路，一種借助生物信息學方法將組裝的序列與CARD(Comprehensive antibiotic research database)等抗性基因數據庫進行搜索和序列比對，這種方法只能鑒定出數據庫中已知的ARGs；另一種方法是將組裝的Contigs進行基因預測獲得開放閱讀框(Open reading frames，ORFs)，功能注釋篩選含有ARGs的ORFs，借助軟件和隱馬爾可夫模型對ARGs進行功能預測，既可以鑒定已知ARGs也可以發現新的ARGs。宏基因組學技術極大方便了科研人員對人類和動物以及環境樣品中抗生素耐藥性的起源、傳播和進化規律進行分析，為微生物群落中新型ARGs的發現提供可能。

3 宏基因組學在奶牛耐藥性研究中的應用

奶牛糞便是人類病原體的已知來源[20]。盡管在糞便中發現的大多數微生物都是非致病性腸道微生物，不易對人類健康構成重大威脅，但它們可能攜帶抗生素抗性基因(ARGs)傳播到環境中其他病原菌體內，使越來越多的病原菌耐藥[21]。奶牛是一種大型草食動物，據估計1頭成年奶牛1年的糞便排泄量大約有1噸。2018年中國奶牛存欄量為720萬頭[22]，大量的奶牛糞便是一種潛在耐藥基因污染源。借助宏基因組學使研究這些ARGs對周邊的環境的影響以及傳播途徑成為了可能。

借助功能宏基因組學構建宏基因組文庫可以功能篩選新型ARGs。以前的研究主要集中在對抗生素使用量大的動物(如豬和雞)的糞便中ARGs的研究。雖然牛糞常用于作物生產，但其受到的關注較少。Wichmann等將功能性宏基因組學與第3代PacBio測序相結合，采集奶牛的糞便樣品構建的對氯霉素、卡那霉素、四環素或β-內酰胺抗性的87個克隆中，80個攜帶獨特的ARGs，其推導的蛋白質序列與GenBank中序列的平均相似度僅為50%～60%，借助基于蛋白質序列的系統發育樹發現了一種新型的氯霉素乙酰轉移酶[23]。

借助宏基因組學可以探究ARGs在奶牛養殖中的傳播規律。科研人員從全國7個主要奶牛養殖省份采集奶牛糞便和奶牛場土壤樣品，采用宏基因組學方法檢測ARGs，發現這些樣品中不僅囊括了幾乎所有主要種類的ARGs，而且具有相當高的豐度，表明奶牛場是一個巨大的耐藥基因傳染源，并具有極強的水平擴散風險。而奶牛場普遍采用糞便堆肥更會加劇ARGs的積累和傳播。另外，糞便和奶牛場土壤樣品中微生物群的ARGs含量和分布呈顯著正相關，表明奶牛養殖加劇了ARGs在土壤中的積累。ARGs的分布流行規律與轉座酶表達豐度顯著相關，表明ARGs擴散傳播的潛在高風險和公共衛生隱患，揭示了動物生產—糞肥—土壤間ARGs的潛在傳播擴散途徑[24]。

在飼養場周圍，空氣中ARGs的含量會被場內使用的抗生素影響。McEachran等[25]采集了10個肉牛飼養場的下風向和上風向的空氣顆粒物，采用高效液相色譜法、質譜連接法、16S rRNA擴增和測序分析等方法研究發現，產生于肉牛飼養場的空氣顆粒物包含不同的細菌群落、抗生素和ARGs。多種獸用抗生素和含有ARGs的微生物群落在空氣顆粒物上重新編碼ARGs，具有大范圍傳播的巨大潛力。這些顆粒物隨著空氣的流動四處擴散，把養殖場中的獸用抗生素、微生物及其攜帶的ARGs傳播到其他環境中去，包括人類生活區。這些攜帶ARGs的微生物在新的環境中也可能借助其他載體繼續傳播擴散[26]。推測有抗生素大量使用的奶牛場很有可能也存在通過空氣顆粒物向外擴散ARGs的情況。

借助宏基因組學可以探究ARGs在奶牛養殖中動物之間的傳播規律[27-28]。為了進一步了解斷奶犢牛和泌乳母牛之間的耐藥性和微生物群落之間的差異，Haley等[29]對來自17個規模化奶牛場的預斷奶小牛和泌乳母牛混合糞便樣品進行了宏基因組測序。結果表明，2個年齡組之間的微生物群落結構和耐藥性存在顯著差異。在所有樣品中均鑒定出各種ARGs，其中最常檢測到的是四環素和氨基糖苷類抗性基因。犢牛的混合糞便樣品中ARGs的含量要比泌乳母牛的豐度和多樣性更高。在耐藥性種類上，小牛糞便中四環素、氨基糖苷類、甲氧芐啶、大環內酯-林可酰胺-鏈霉菌素B和β內酰胺類等的耐藥基因的相對豐度顯著高于泌乳母牛糞便。這項研究的結果表明，與泌乳母牛的糞便相比，斷奶小牛的糞便中含有不同的細菌群落和耐藥基因組，在斷奶小牛的糞便中檢測到更多的耐藥基因。

4 展望

奶牛養殖會產生大量的廢棄物，是一個巨大的耐藥基因庫。借助宏基因組學方法研究發現，在奶牛養殖中，ARGs在不同年齡的奶牛間，糞便—土壤間，以及牧場—空氣間肆意傳播擴散，應該引起足夠重視。一方面借助宏基因組方法繼續探索完善ARGs在奶牛養殖各個環節中的傳播規律以及明確養殖中ARGs對周圍農田、土壤、河流、植被以及人類生活的影響，另一方面提示動物養殖中ARGs的廣泛傳播對周圍環境的污染、對人類公共健康是一個巨大的威脅，也提示動物養殖場應做好糞便污水等廢棄物的凈化處理工作。未來應繼續探究和實踐抑制養殖環境中ARGs產生與傳播的方法，減緩或切斷ARGs在病原菌間的傳播途徑，降低ARGs對公共健康的威脅。監測和應對抗生素耐藥性的未來在于成功地將基于培養的細菌分離鑒定、全基因組學、宏基因組學等多種技術相結合，以快速識別和追蹤ARGs的進化傳播規律，為人類尋找應對措施搶占先機。