化膿隱秘桿菌致病性與致病機(jī)理研究進(jìn)展

楊 潔 ， 蔣 威 ， 沈文祥 ， 馬曉宇 ， 李亞娟 ， 武小虎 ， 丁學(xué)智 ， 李宏勝 ， 王勝義 ， 嚴(yán)作廷

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物重點實驗室 ， 甘肅 蘭州 730000)

化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)，隱秘桿菌屬，放線菌科，革蘭染色陽性菌，無鞭毛，不產(chǎn)生芽孢和莢膜，不規(guī)則短桿狀，菌體大小為 (0.2～0.3) μm× 2 μm。需氧或兼性厭氧，在37 ℃、5% CO2、含有5%牛血清或綿羊血的瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈灰白色，圓形，表面光滑隆起，針尖大小，有溶血環(huán)，無特殊氣味。該細(xì)菌不耐熱，60 ℃短時間內(nèi)可被殺死，對常用化學(xué)消毒劑敏感。對于化膿隱秘桿菌的識別鑒定可以用傳統(tǒng)的生化鑒定，不過近年來16S rRNA的基因序列分析、PCR或RT-PCR檢測特異性基因、間接免疫熒光等分子生物學(xué)方法也得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]。

1 致病性

化膿隱秘桿菌作為一種共生菌，可存在于健康動物的皮膚、上呼吸道及泌尿生殖道黏膜表面[3-5]。但是，化膿隱秘桿菌也是一種重要的機(jī)會致病菌，可以感染豬牛羊等家畜[6-7]、野生動物[8-10]、伴侶動物[11]甚至人類[12-13]，引起患病動物組織化膿性感染，進(jìn)而導(dǎo)致乳房炎、子宮炎[14]、子宮內(nèi)膜炎[15]、肺炎[7]、心內(nèi)膜炎[12]、腎盂腎炎[13]、肝膿腫[16]和敗血癥[17]等，降低生產(chǎn)性能，造成動物淘汰，給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至威脅著人類的健康。

1.1 化膿隱秘桿菌感染家畜 化膿隱秘桿菌可以入侵奶牛子宮，引起子宮炎或子宮內(nèi)膜炎[14-15]。由于奶牛生產(chǎn)過程中子宮內(nèi)膜完整性遭到破壞，化膿隱秘桿菌可以趁機(jī)侵入子宮的基質(zhì)細(xì)胞，招募炎性因子，導(dǎo)致組織損傷，產(chǎn)生炎性灶。化膿隱秘桿菌的入侵還可以改變卵泡的微環(huán)境，使得卵母細(xì)胞的發(fā)育受到影響，引起奶牛不育，最終可能導(dǎo)致奶牛淘汰[18]。化膿隱秘桿菌還可以引發(fā)乳房炎，使得奶牛產(chǎn)奶量下降[6]。且奶牛產(chǎn)后常發(fā)疾病，子宮炎、子宮內(nèi)膜炎和乳房炎通常是由化膿隱秘桿菌與其他細(xì)菌(如大腸桿菌、鏈球菌和葡萄球菌等)混合感染，為臨床該疾病的治療增加了困難。化膿隱秘桿菌還是導(dǎo)致肉牛及奶牛發(fā)生肝膿腫的病原菌之一，有研究表明，由該疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)平均每年6千萬美元[19]。此外，在1個2月齡犢牛慢性纖維化附睪炎的病例中也分離到了化膿隱秘桿菌[20]。化膿隱秘桿菌還可以引發(fā)肺炎、腦炎和淋巴結(jié)炎等，嚴(yán)重威脅牛群的健康。

化膿隱秘桿菌可以感染豬，造成肺炎[21-22]及胸膜炎，且常常與某些免疫抑制性疾病(如豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病)并發(fā)或繼發(fā)感染，導(dǎo)致感染動物的淘汰及感染部位肉品的損失，防控難度大，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。某些研究還表明某些心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、生殖道感染及敗血癥也與化膿隱秘桿菌有關(guān)。

化膿隱秘桿菌還可以感染綿羊及山羊，導(dǎo)致肺炎、淋巴結(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、生殖道感染、乳房炎、睪丸炎及敗血癥。

1.2 化膿隱秘桿菌感染野生動物 化膿隱秘桿菌同樣可以感染野生動物。有研究報道，化膿隱秘桿菌可以引起白尾鹿的顱內(nèi)化膿性腦膜炎，白尾鹿還可以作為化膿隱秘桿菌的保藏宿主，成為該菌感染家畜的潛在威脅[23]。在因疾病淘汰的歐洲野牛的病灶組織樣品中，例如淋巴結(jié)、肺、肝及生殖器，經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢測也分離到了化膿隱秘桿菌[9]。

1.3 化膿隱秘桿菌感染伴侶動物及人類 與生產(chǎn)性動物相比，化膿隱秘桿菌感染貓狗等伴侶動物的病例報道較少。但據(jù)文獻(xiàn)報道，在貓的外耳道炎以及犬的膀胱炎中也可以分離到化膿隱秘桿菌[11]。人類也可以感染化膿隱秘桿菌，引起心內(nèi)膜炎、軟組織感染、腎盂腎炎及敗血癥等[13,24]。

2 致病機(jī)理

一些毒力因子，如溶血素(Pyolysin，PLO)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，Nan)、膠原結(jié)合蛋白(Collagen-binding protein A,CbpA)、菌毛(Fimbria，F(xiàn)im)等，在化膿隱秘桿菌對宿主的黏附、定植，以及炎癥和組織損傷的過程中發(fā)揮重要作用。

2.1 溶血素 溶血素是一種膽固醇依賴的細(xì)胞毒素(Cholesterol-dependent cytolysin，CDCs)[25]，最早在1996年被純化出來，溶血素可以溶解紅細(xì)胞，還可以對其他宿主細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞等)發(fā)揮作用，是化膿隱秘桿菌最主要的毒力因子。其主要機(jī)制在于溶血素可以與細(xì)胞膜結(jié)合并形成跨膜小孔，破壞宿主細(xì)胞膜的完整性，造成細(xì)胞破碎死亡。PLO表達(dá)缺陷的化膿隱秘桿菌菌株感染小鼠，表現(xiàn)較差的感染性及致病性，PLO特異的抗體可以完全中和化膿隱秘桿菌的溶血活性，說明PLO是該菌產(chǎn)生的唯一溶血素。腹腔或靜脈注射PLO，可以導(dǎo)致小鼠和兔子死亡，使豚鼠出現(xiàn)皮膚壞死。溶血素plo基因上游的2個啟動子P1、P2是plo基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列[26]。化膿隱秘桿菌處于生長穩(wěn)定期時溶血活性到達(dá)頂峰，plo基因上調(diào)表達(dá)，且P2啟動子在調(diào)節(jié)中占據(jù)主導(dǎo)地位。成熟PLO分子的分子量大小為55.1 kDa，是一個氧穩(wěn)定、熱不穩(wěn)定的蛋白，pH小于3或大于11時被破壞，對蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶敏感。其他革蘭陽性菌(如肺炎鏈球菌、豬鏈球菌)也可以產(chǎn)生溶血素，但PLO的基因序列與細(xì)胞溶素家族的其他成員僅有38%～45%的一致性，58%～64%的相似性。與大部分CDCs不同，PLO的活化不需要硫醇的激活，這種差異是由十一氨基酸多肽的序列中的半胱氨酸(即硫醇的活化位點)替換為丙氨酸而導(dǎo)致的，這一替換對溶血活性沒有本質(zhì)的影響，但改變了該蛋白的氧穩(wěn)定性。基于PLO蛋白的分子結(jié)構(gòu)，人工構(gòu)建出重組蛋白作為抗原接種到實驗動物體內(nèi)，使得實驗動物獲得了一定的免疫保護(hù)效果，表明PLO蛋白可作為化膿隱秘桿菌潛在的疫苗分子靶標(biāo)[27]。

2.2 菌毛 化膿隱秘桿菌是少數(shù)可以產(chǎn)生菌毛(Fimbria)的革蘭陽性菌之一，菌毛呈細(xì)絲狀，長200～700 nm，寬2.5～4.5 nm，一個菌體表面一般不超過10條。化膿隱秘桿菌產(chǎn)生的菌毛有5種，分別是FimA、FimB、FimC、FimE及FimG，分別由fimA、fimB、fimC、fimE及fimG基因編碼。其中FimA菌毛的分子量大小為45.7 kDa，是化膿隱秘桿菌中的優(yōu)勢菌毛。研究表明，分離自產(chǎn)后奶牛的菌株fimA基因的攜帶率為100%，fimC、fimE和fimG的攜帶率分別為67%、98%和67%[3]，分離自豬肺炎的菌株fimA的攜帶率為100%，fimC和fimE基因的攜帶率分別為29.6%和59.3%[7]。當(dāng)fimA表達(dá)量較少時，可以限制其他菌毛的形成，而該菌毛上調(diào)表達(dá)時，可能意味著化膿隱秘桿菌由共生菌轉(zhuǎn)變?yōu)榱酥虏【?/p>

2.3 膠原結(jié)合蛋白 化膿隱秘桿菌還表達(dá)一些其他的與黏附相關(guān)的蛋白，這些蛋白與菌體細(xì)胞壁相連，稱為細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白，通過結(jié)合宿主的細(xì)胞外基質(zhì)分子來促進(jìn)細(xì)菌的黏附和定植[28]。其中膠原結(jié)合蛋白是最重要的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白，分子量大小為121.9 kDa，由cbpA基因編碼。膠原結(jié)合蛋白可以與各種膠原蛋白結(jié)合，可以促進(jìn)菌體對上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的黏附，這也是化膿隱秘桿菌更容易在富含膠原蛋白的組織中定植的原因。據(jù)文獻(xiàn)報道，cbpA基因的攜帶率在7.2%～100%不等[3,7,17]。

2.4 神經(jīng)氨酸酶 神經(jīng)氨酸酶在唾液酸代謝中發(fā)揮重要作用，能夠在宿主細(xì)胞表面受體如糖蛋白、糖脂、碳水化合物等大分子中將唾液酸裂解，從而促進(jìn)細(xì)菌的黏附。神經(jīng)氨酸酶還可以降低黏液的黏性來促進(jìn)菌體的定植。此外，它還可以通過暴露IgA抗體，使抗體被細(xì)菌分泌的蛋白酶裂解，來削弱宿主的免疫應(yīng)答。NanH和NanP是化膿隱秘桿菌產(chǎn)生的2種主要的神經(jīng)氨酸酶，分子量大小分別為107 kDa和1 868 kDa，分別由nanH和nanP基因編碼。很多的革蘭陽性菌、陰性菌及病毒都可以產(chǎn)生神經(jīng)氨酸酶。

2.5 生物被膜 生物被膜(Biofilm)是微生物抵抗外界不良環(huán)境的一種特性，可以提高細(xì)菌的耐藥性、黏附性，以及抵抗宿主的免疫應(yīng)答。形成生物被膜是指細(xì)菌可以分泌一些胞外多聚物如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等，形成一種致密的結(jié)構(gòu)，使得細(xì)菌由懸浮態(tài)變?yōu)轲じ綉B(tài)。研究表明，不同物種及不同感染部位的化膿隱秘桿菌都具有形成生物被膜的能力。生物膜的形成主要由調(diào)節(jié)系統(tǒng)PloS/PloR來控制，PloR作為一種活化劑，可以上調(diào)生物膜的形成。噬菌體UFV13可以顯著降低化膿隱秘桿菌生物被膜的形成，這一結(jié)果為治療化膿隱秘桿菌感染提供了新的思路[29]。

3 展望

化膿隱秘桿菌是一種重要的機(jī)會致病菌，可以感染豬、牛、羊等家畜，野生動物，伴侶動物甚至人類，造成各組織器官的化膿性感染，給畜牧業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至威脅著人類的健康。一些已知的毒力因子(如溶血素、膠原結(jié)合蛋白、神經(jīng)氨酸酶、菌毛等)在化膿隱秘桿菌對宿主細(xì)胞的黏附、定植、致炎及組織損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。此外，生物被膜的形成使得藥物在體內(nèi)難以發(fā)揮應(yīng)有的作用，為該細(xì)菌的臨床治療增加了難度。關(guān)于化膿隱秘桿菌毒力因子與宿主細(xì)胞之間具體的相互作用以及共生菌與致病菌之間角色轉(zhuǎn)換的影響因素等方面還有待進(jìn)一步研究。