飼料及動物源食品中重金屬檢測技術的研究進展

李潤嫻 溫 洋 王鳳來 賀平麗

(中國農業大學動物科技學院，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193)

民以食為天，食品安全一直是與所有人息息相關的社會熱點問題。隨著社會經濟和工業化進程的高速發展，重金屬以工業采礦、廢氣排放、污水灌溉和工業產品重金屬超標等方式不斷地排放入大氣、水體和土壤中。排放的重金屬不但難以被降解，還會通過被污染的大氣、水源和土壤轉移到植物和動物體內持續富集，從而導致各類水產和畜禽產品中多種重金屬化合物含量超標，并通過食物鏈對人和動物的健康造成嚴重威脅[1-3]。例如，在日本發生的水俁病就是由于汞污染所造成的；鉛廣泛存在于石油、電池、電纜和管道中，對人的骨髓造血系統和神經系統有很大危害；三價鉻是人體必需的微量元素，也是皮革生產中的重要物質，但是在一定條件下被氧化成六價鉻就會產生強烈的毒性。為此，我國食品安全國家標準嚴格規定了各種食品、糧食以及飼料中重金屬鉛、鎘、汞、砷、鉻、銅、鋅等的限量指標[4]。發展精準高效的重金屬元素檢測方法，對食品安全的監管有著重要意義。本文綜述了含重金屬元素樣品的前處理技術和檢測方法及其在飼料以及動物源食品中應用的研究進展，以期為畜牧生產中重金屬地有效防控提供重要的信息支撐。

1 前處理技術

檢測方法分為樣品前處理和樣品檢測2個部分，飼料和食品等樣品基質較為復雜且重金屬含量較低，采用合適的前處理方法尤為重要。目前，飼料和食品中重金屬測定的前處理技術主要有干灰化法、濕法消解法、微波消解法、無需消解的直接進樣技術以及萃取技術[5-9]。干灰化法是將樣品高溫灼燒除去有機物，然后把剩余的灰分用鹽酸溶液溶解后待測。這種方法操作較為簡單，可處理的樣品量大，但缺點是處理時間過久，在高溫環境下無法準確測定一些易揮發的元素。濕法消解法則是使用強酸作為強氧化劑使樣品中的有機物氧化分解，釋放樣品中的無機物質用于后續檢測。濕法消解法的應用范圍較為廣泛，也可以處理大批量樣品，但是由于消化過程中所用的強酸量較大，容易造成污染，并且也相對耗時。微波消解法是近年來應用較為廣泛的前處理方法，它是采用硝酸處理樣品，通過微波電場使分子進行高速的碰撞摩擦，在封閉容器內釋放出大量氣體和熱量，從而使體系溫度和壓強升高，加快消解速度。相對于前述2種方法，微波消解法效率高、回收率高、損失小、污染小，非常適用于食品中重金屬元素分析的前處理，但其缺點在于成本較高，對樣品均勻性要求較高。無需消解的直接進樣技術不需要進行消解步驟，通過懸濁液進樣或固體直接進樣，將樣品直接導入儀器中進行檢測。這種方法大大節省了樣品前處理時間，降低了樣品的損耗和有毒試劑的使用，但是也存在樣品的基質干擾、受熱不均、代表性差等缺點。近年來，有研究者采用萃取技術對待測物進行分離和富集，以降低基質干擾，提高檢測結果的準確性。萃取技術一般是利用表面活性劑的溶解性、金屬的配合能力以及一些高親和力的吸附劑等，將目標金屬從復雜樣品中提取出來，達到分離和富集的目的。目前，各式各樣的萃取技術如濁點萃取、液相微萃取、固相微萃取等逐漸成為重金屬儀器分析技術中不可缺少的一環，極大地提高了檢測的靈敏度和準確性。

2 檢測技術

2.1 儀器分析

2.1.1 原子光譜法

原子光譜法主要包括原子吸收光譜法(atomic absorption spectrometry,AAS)、原子發射光譜法(atomic emission spectrometry,AES)和原子熒光光譜法(atomic fluorescence spectrometry,AFS)。

原子吸收光譜法是由待測樣品中氣態基態原子對光源發出的該原子的特征波長光產生共振吸收，其吸光度與蒸汽相中被測元素的基態原子濃度在一定范圍內成正比，從而對試樣中元素進行定量的一種分析方法。原子吸收光譜法發展時間較長，技術比較成熟，其準確性高、靈敏度高、分析速度快、應用范圍廣，是測定金屬元素的常用方法。但此方法局限性在于不能同時做多元素分析，測定的元素種類有限，不適用于難熔元素。Silva等[7]建立了一種快速、低成本測定貓糧中總汞的光化學蒸汽發生-冷蒸汽原子吸收光譜法。他們對有機酸前體、自由基生成濃度、汞光還原濃度、樣品紫外輻照時間和載氣流量等條件進行了優化，在最優條件下，此方法檢出限達到0.28 μg/kg，并用該方法對含有金槍魚和其他海鮮成分的貓糧樣品進行了檢測。Borahan等[10]采用深共晶溶劑基液相微萃取進行富集后，通過火焰原子吸收光譜系統測定了牛奶樣品中的痕量鉛。此方法線性范圍較寬，在50～1 000 μg/L，檢出限和定量限分別達到8.7和29.0 μg/L，檢測功率比常規原子吸收光譜系統提高了48倍，為牛奶樣品中痕量鉛的檢測提供的新思路。Huang等[11]用殼聚糖/硫醇改性金屬有機骨架(CS/MOF-SH)作為吸附劑，采用石墨爐原子吸收光譜儀檢測，建立了固相萃取法分析痕量鉛離子(Pb2+)和鎘離子(Cd2+)，檢出限分別為0.033和0.008 μg/L，此方法可以檢測多種基質復雜的標準物質(水稻、小麥和茶葉)中痕量Pb2+和Cd2+，說明其在實際樣品中監測痕量重金屬離子方面有很大的潛力。Xing等[12]建立了一種快速檢測谷物樣品中Cd2+的新型固體采樣結合電熱汽化原子吸收光譜法，在最佳條件下，檢出限為0.15 ng/g。此方法不進行酸消化，儀器分析時間控制在3 min以內，包括樣品制備時間在內的整體分析時間控制在10 min以內。

原子發射光譜法的基本原理是待測樣品中的元素經過激發后，發射特征光譜，根據該特征光譜的信息來計算待測樣品中重金屬的含量。該方法可以進行多種金屬元素的定量測定，也可以用于未知樣品中金屬元素的定性識別。在電感耦合等離子體(inductively coupled plasma，ICP)作為激發光源時，可以獲得較高的靈敏度和較寬的線性范圍。但是原子發射光譜的譜線較為復雜，所以容易受到樣品組分基質等因素的干擾。Bozorgzadeh等[13]報道了一種色散固相微萃取結合電感耦合等離子體發射光譜法測定魚類樣品中有毒重金屬。該法采用了基于果膠包覆磁性氧化石墨烯的分散微固相萃取法來富集痕量Pb2+、Cd2+、汞離子(Hg2+)、鈷離子(Co2+)和鎳離子(Ni2+)，在鮮魚樣品中的檢出限和定量限分別在0.01～0.21 μg/g和0.04～0.67 μg/g。該方法成功地實現了11種不同魚類中有毒重金屬的定量測定。

原子熒光光譜法是將待測原子蒸汽在輻射能的激發下由基態躍遷至激發態，再從激發態返回基態時輻射出的熒光，根據熒光的強度對待測元素進行定量分析。此方法靈敏度高，線性范圍寬，譜線簡單，能輕松地同時測定多種元素，但僅能檢測具有熒光發射的元素，適用分析的元素種類有限且檢測費用較高。目前，原子熒光光譜法主要用于砷和汞的測定。例如，Song等[14]合成了一種羥基磷酸銅-有機金屬骨架復合物作為固相分散萃取劑，并結合原子熒光光譜成功測定了大米中的痕量汞。該方法在大米樣品中的加標回收率在98.8%～109.0%，檢出限為0.012 5 ng/mL。Castor等[15]建立了一種簡便、廉價、快速地測定玉米和水稻樣品中砷含量的方法。該方法是基于O,O-二乙基二硫代磷酸(DDTP)絡合物濁點萃取富集砷，其中DDTP用聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-114)作為表面活性劑從體外萃取物生成的，然后用氫化物發生系統(HG-AFS)進行原子熒光光譜檢測。該方法對水稻和玉米樣品的檢出限分別為1.34和1.90 μg/kg。通過對標準對照樣品(米粉)進行分析，證實了該方法的準確性。試驗中用該方法分析了玉米和水稻樣品，均顯示出較高的生物可及性砷含量(分別為72%～88%和54%～96%)，表明存在潛在的損害人類健康的風險。

2.1.2 質譜分析法

電感耦合等離子體質譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)是以電感耦合等離子體為離子源，在質譜儀中按照質荷比分離待測物，根據質譜結果對大多數元素(除了汞)進行定性和定量分析的方法。ICP-MS比原子光譜法更靈敏，不僅可以在短時間內同時分析多種金屬元素，還可進行同位素的快速測定，與液相色譜儀等儀器聯用時可進行元素形態分析，目前在重金屬檢測中得到了廣泛的應用。但是ICP-MS易受質譜、基體效應、電離等的干擾，其設備昂貴，運行和維護成本較高。Qin等[16]設計了一種羧基功能化中空聚合物微球作為吸附劑裝入固相萃取柱，然后用ICP-MS同時測定消化后的紫菜、魚肉和雞肉中的釩離子(V5+)、鉻離子(Cr3+)、銅離子(Cu2+)、Cd2+和Pb2+。該方法在食品樣品中對目標金屬元素的檢出限為0.20～0.80 μg/kg。Herath等[17]建立了一種超高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用(UPLC-ICP-MS)同時測定不同形態砷的快速分析方法，還可以同時精確分離并定量測定亞砷酸、砷酸鹽、二甲基胂酸鹽和一甲基胂酸鹽。此方法對不同形態砷的檢出限在0.3～0.5 μg/L；該研究還定量檢測了澳大利亞和斯里蘭卡商用水稻中不同形態的砷，形態分析結果表明，砷離子(As3+)在水稻樣品中廣泛分布。UHPLC-ICP-MS能準確、可靠地鑒定和定量不同形態的砷，并且具備分離速度快、分辨率高、檢出限低等優點。

2.2 快速檢測技術

傳統的儀器檢測方法雖然可以精確測定樣品中的各類重金屬含量，但是對昂貴的大型儀器和專業的檢測人員需求，大大提高了它們的分析成本，也成為進行大量樣本實時快速檢測的一大阻礙。快速檢測技術建立在免疫學、納米材料學、光譜學、電化學等交叉學科上，其檢測成本低、快捷、操作簡單、可進行半定量和定量分析。

2.2.1 比色法

比色法是一種基于金屬離子與溶液中的物質相互作用直接引起顏色或熒光信號改變，根據溶液中顏色的深淺來測定待測物質含量的快速檢測方法。此方法簡單直觀，分析速度快，但靈敏度低并且非常容易受到復雜基質的干擾。研究者常利用金屬與螯合劑生成穩定的有色金屬螯合物來進行重金屬的定量測定[18]。例如，Wang等[19]建立了一種快速測定動物飼料、寵物食品和飲用水中鋅的微平板比色法。用三氯乙酸提取樣品中的鋅離子，與2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(N-丙烷-N-磺基丙基氨)-苯酚(5-Br-PAPS)反應形成鋅-PAPS配合物；篩選出由水楊醛肟、去鐵胺、檸檬酸鈉等成分組成的掩蔽配方，排除其他重金屬的干擾；并提出一種分配校正方法，消除飼料樣品產生的基質效應。整個檢測過程可以在40 min內完成，線性范圍在0.038～8.000 μg/mL，實際樣品的分析結果與原子吸收光譜分析結果有較好的一致性。比色法的特異性比較差，在復雜基質中的抗干擾能力也較差，現有的報道中大多是應用在基質相對簡單的液態樣品中，在復雜固態樣品中的應用比較受限[20]。

2.2.2 電化學分析法

電化學分析法是以電化學反應池中的電極發生氧化還原反應引起的電化學信號的變化為基礎，根據電流、電位、電導等參數與待測物質之間的關系來進行定性和定量檢測的一種分析方法。電化學分析法靈敏度高，設備簡單，但是其特異性、重現性和抗干擾能力目前還有待提高，需要利用納米材料對電極進行修飾才能實現較好的檢測性能。電化學分析法在重金屬離子檢測中的應用主要有溶出伏安法、極譜法、離子選擇電極法等。例如，王忠政等[21]建立了一種多壁碳納米管/Nafion溶出伏安法，并成功應用于大豆和大米中重金屬鉛的測定。此方法線性范圍為0.1～20.0 μmol/L，檢測大豆和大米中鉛的回收率在98.75%～101.25%，相對偏差小于5.63%，檢測結果與ICP-MS的檢測結果相符，可以作為糧油安全的有力監測手段。

2.2.3 免疫分析法

免疫分析法是一種使用抗體識別和捕獲目標抗原或半抗原，再根據顏色、光譜等信號的變化進行定性和定量的檢測方法。雖然相對于儀器檢測方法免疫分析法擁有許多優勢，如操作簡單、特異性強、靈敏度高、適用于現場監測等，但是重金屬的抗體制備難度較大，價格較高，使其發展受到了限制。在制備重金屬的單克隆抗體時，一般采用重金屬-螯合劑-載體蛋白質復合物作為免疫原，可以使重金屬離子獲得免疫原性，并防止其在動物體內與生物分子發生不可逆反應導致免疫動物中毒[22-23]。目前飼料和食品中研究較多的主要有酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和免疫層析法(ICA)。Xu等[24]制備了Pb2+的單克隆抗體，此單抗對其他金屬離子的交叉反應性小于0.943%，具有較高的特異性。基于此抗體建立了ELISA和化學發光酶免疫分析法(CLEIA)用于Pb2+的檢測，檢出限分別為0.7(ELISA)和0.1 ng/mL(CLEIA)，并成功應用于雞肉、大米、牛奶等食品中Pb2+的檢測。王亞楠等[25]制備了Cd2+的高特異性單克隆抗體，并用膠體金標記抗體建立了免疫層析試紙條，檢出限為5 μg/L，該試紙條可以在10 min內對面粉、豬肉樣品中的Cd2+進行半定量測定，非常適合食品中重金屬的現場初篩。

2.2.4 生物傳感器

生物傳感器是一種對生物物質(包括酶、抗體、抗原、微生物、核酸等)敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器。近年來，功能核酸作為分子識別元件的生物傳感器在重金屬檢測中研究應用最廣泛[26-30]，是重金屬生物傳感器研究的熱點之一。功能核酸是一類可替代傳統蛋白酶和抗體，具有獨立結構，執行特定生物功能的核酸分子。其性質穩定，價格低廉，易于裁剪和修飾，包括適配體、切割核酶、錯配核酶等眾多類別。

適配體是通過指數富集的配體系統進化(SELEX)技術體外篩選得到單鏈DNA或RNA，是一種由100個以內的堿基構成的功能核酸，具有親和力高、特異性強、易于修飾等特點，可以折疊成特定的二級或三級結構，特異性結合包括重金屬在內的多種靶分子[31-32]。Khoshbin等[33]建立了一種低成本的紙基適配體傳感器陣列，可同時檢測汞離子(Hg2+)和銀離子(Ag+)。該傳感陣列是根據靶樣品注入傳感平臺后，Hg2+和Ag+的特異性適配體的構象變化及其在氧化石墨烯表面的釋放情況，通過監測熒光隨離子濃度的變化進行定量檢測，檢出限分別低至1.33和1.01 pmol/L。該傳感器可在10 min左右同時檢測2種離子，并成功應用在人血清、水和牛奶的檢測中。Liu等[34]設計了一種基于長鏈適配體功能化上轉換納米顆粒(UCNPs)和短鏈適配體功能化金納米顆粒(GNPs)的熒光共振能量轉移體系，開發了一種檢測Hg2+的納米傳感器。在沒有Hg2+的情況下，由于2個適配體通過堿基互補配對結合，導致UCNPs與GNPs之間發生熒光猝滅；在Hg2+存在的情況下，由于Hg2+與胸腺嘧啶之間的穩定結合作用，長鏈適配體折疊成發夾結構，導致從UCNPs釋放GNPs，從而使猝滅的熒光恢復。此方法可以成功應用于牛奶中Hg2+的檢測，線性范圍在0.2～20 μmol/L。

金屬離子依賴型切割核酶(DNAzyme)，是一類當特定金屬離子作為輔助因子存在時，可以催化切割底物鏈使其斷裂的功能核酸。切割核酶由于成本低、易于合成、性質穩定，且具有高度的離子特異性，在重金屬分析領域備受關注，但是目前只有部分重金屬離子有特異性切割核酶，切割核酶傳感器在飼料和食品重金屬檢測中應用還很少[35-37]。金屬離子依賴型錯配核酶是另一類重金屬檢測領域中常用的功能核酸，錯配核酶是指DNA的2個胸腺嘧啶堿或2個胞嘧啶本不可以配對，但可以分別結合Hg2+和Ag+，錯配連接形成穩定的“T-Hg2+-T”和“C-Ag+-C”結構，從而進行重金屬識別[38]。例如，Yuan等[39]利用T-Hg2+-T結構，通過Au@gap@AuAg納米棒并排組裝，開發了一種新型級聯靈敏度的拉曼電化學生物傳感器，用于Hg2+的檢測，此傳感器靈敏度可達到0.001 ng/mL。該研究還檢測了一批飼喂高汞飼糧的雞所產雞蛋中的汞含量，發現蛋黃中汞的含量是蛋白中的20倍。

3 小 結

重金屬的排放使環境污染日益突出，造成了食品安全問題，對人類和動物的健康造成了嚴重的威脅，本文綜述了目前在飼料和食品領域中對重金屬常用的前處理方法和分析技術。傳統的原子光譜法、質譜法等儀器檢測方法已經相對成熟，完成了從單一元素分析到多元素分析再到不同形態元素分析的發展，并建立了各種從樣品中萃取富集痕量元素的方法，可滿足不同的檢測需求，但是由于大型儀器的使用，阻礙了這些方法在現場快速檢測中的應用。近年來，以生物識別分子為基礎的生物傳感器和免疫分析法有著靈敏、快速、操作簡單、適用于現場檢測等獨特優勢，不僅成為了重金屬分析領域的研究熱點，也是重金屬檢測的未來發展趨勢。目前，這些方法也存在一些問題亟待解決：樣品前處理過程還需要進一步簡化并減少污染；生物敏感元件成本較高，使用條件和范圍還需拓寬；尚未實現不同種類不同形態的元素同步檢測；檢測設備還需要向微型化和便攜化方向發展。核酸生物傳感器已經在重金屬檢測領域展現出巨大優勢，但是在飼料以及動物源食品中的應用還未得到拓展。免疫層析試紙條是現場初篩各類有毒有害物質以及生物標志物的有力方法，但是目前高質量重金屬抗體的穩定制備和應用還處于初級階段。隨著抗體制備、適配體篩選、DNAzmye篩選、納米材料合成、微流控系統等技術的日益發展，這些快速檢測方法將會在重金屬檢測領域有更加實用的成果和更加廣闊的應用前景。