淺析PCR技術及其在食品微生物檢測中的應用

◎ 許競思

（福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350000）

隨著人們對生活質量要求的提高，食品安全問題在人們心中的關注度不斷提升，這在一定程度上促進了我國食品安全檢查部門在工作上的調整與發展。采用更加先進的技術進行食品安全檢測，能夠進一步保證食品質量，確保消費者能夠購買到放心的食品。相對于其他微生物檢測技術，PCR檢測技術依靠其高精準性和高效率等特點脫穎而出，在一定程度上給食品檢測部門的食品微生物檢測工作帶來了巨大便利。通過該技術的應用，能夠在更短的時間內檢測出食品中的致病菌情況，例如某地出現食物中毒群體事件，通過PCR檢測技術快速檢出食物中的病原微生物種類，及時為患者的救治提供方向；并且PCR檢測技術能夠通過實驗的方式推斷出食品在生產后階段內微生物的繁殖速度與最大繁殖量，能夠在具有預見性的基礎上對食品安全進行有效檢查。

1 PCR技術及其在食品微生物檢測中的作用

1.1 PCR技術原理

PCR技術應用于食品微生物檢測的原理可簡要概括為：經高溫變形、低溫退火及中溫延伸等3步不同環節反復操作，從而檢測微生物的核酸序列，通過利用單個核酸分子序列完成復制，達到擴增的目的。具體分析PCR技術的應用原理，需根據溫度不同整合信息，即高溫變形[1]。被檢測食品微生物處于雙鏈狀態的DNA序列于溫度高達94 ℃狀況下變性，成功解鏈，以雙鏈形式存在，低溫退火。55 ℃下，被檢測微生物特異性引物與處于單鏈狀態的DNA進行融合，中溫延伸。72 ℃下，需以被檢測微生物引物的引導延伸為條件進行復制，檢測微生物的DNA序列。以上所述3點，PCR的應用需反復操作，直至獲取足量被檢測微生物的DNA序列，以達到PCR技術檢測要求。

1.2 熒光定量PCR技術

熒光定量PCR技術是食品進行微生物檢測中的主要技術手段，其主要依靠的是熒光傳遞技術對微生物基因進行標記，并通過記錄不同時間內被標記DNA的數量，檢測微生物的繁殖能力。在該技術的具體實施中，主要是依賴受體發色團之間的偶極—負極之間的相互影響與相互聯系實現的，并結合能量進行轉移的方式進行檢測，供體發色基因-受體發色基因會表現出不同強度的熒光，并且熒光的強度與DNA的產生數量呈正比關系[2]。所以在進行實際檢測的過程中，可以將該技術應用其中，通過記錄靶序列初始濃度，檢測反應過程中熒光實際濃度來得到所需要的檢測結果。在該檢測技術的實際應用中，能夠對食品中所含有的微生物進行基因標記和基因復制，即使食品中含有的微生物數量較少，同樣可以通過標記與記錄初始濃度的方式進行食品微生物檢測。該檢測方式具有自動化高，操作簡單、準確性高等特點，適用于我國當前的食品環境市場。因此，該檢測技術在實際檢測中得到諸多應用，有著極高的發展與普及速度。

2 PCR技術在實際應用中的測定方法

PCR技術在食品檢測中有著十分出眾的表現，并且應用范圍廣泛。例如，在食品檢測中最常見的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等，都能夠通過PCR檢測方式進行有效檢測。以金黃色葡萄球菌為例，其在水果、蔬菜中繁殖速度很快，如果水果、蔬菜存放時間較久，則果蔬的表面很容易繁殖大量的金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌的代謝產物腸毒素對人體的損傷很大，嚴重的情況下會導致食用者出現食物中毒情況。因此，在對食品檢查的過程中，就需要對類似菌進行科學檢查，排除其給人體造成的威脅隱患。本文所研究的PCR技術，就能夠對被檢測食物樣品中的相關物質及微量元素進行檢測，并且檢測精準度極高，食品生產企業采用該技術進行出廠檢驗，能夠有效避免這些不合格的食品流入市場[3]。在具體檢測中，其主要的檢測手段是對特定蛋白進行標記，并且通過對蛋白的檢測，間接獲得被檢測微生物的含量。PCR技術在食品微生物檢測中的應用十分廣泛，能夠針對不同被檢測菌展開有效檢測，提高檢測的準確性。

2.1 常規PCR檢測法

常規PCR檢測法是進行食品微生物檢測中最常用的檢測手段，其主要是針對測定目標物質的DNA模板和與其反應的引物進行混合。在檢測的過程中，在混合后的混合物內加入一定量的聚合酶就能夠制作成最基本的檢測樣本。在后期的檢測中，還需要在特定的溫度與反應條件下進行培養反應。在適合的溫度下，添加了聚合酶的混合物會在聚合酶的作用下促使目標物質進行基于電腦模板序列下的擴增，在經過多個周期后，模板DNA片段可以不斷地復制與擴增。在實際檢測工作開展中，測定物上特定DNA能夠反映出被檢測食物在特定時間內會產生的物生物種類與數量。常規的檢測手段主要是利用了DNA的復制能力與擴增能力，將潛在的、少量的微生物群形成可觀的微生物群，實現基本的食品微生物檢測。

2.2 多重PCR檢測法

多重PCR檢測法是基于常規檢測方法上進行改變與創新形成的檢測方法。常規檢測方法采用的是單引物的方式進行檢測，而多重PCR檢測手段則是采用多個DNA引物進行檢測。例如，在同一個PCR反應體系內，需要加入兩個或兩個以上的反應引物，這些反應引物同樣需要在聚合酶的作用下進行復制與擴增。由于在反應前加入了多個DNA引物，再通過聚合酶反應后，能夠得到多個不同的DNA反應片段。因此，多重PCR檢測方式能夠針對微生物的多個致病因子進行分析與測定，可以大幅度提高檢測的準確率與效率。相比較常規PCR檢測法而言，其所分析出的致病因子更多，可以避免檢測過程中出現被檢測菌遺漏的情況，是提高檢測嚴謹性的有效方法。因此，在當前食品微生物檢測中，除了對具有針對性的致病菌進行檢測以外，大多數情況下會采用多重PCR檢測法進行食品微生物檢測，能夠在最大程度上降低檢測內容遺漏的情況發生，有效縮短了檢測時間，提高了檢測的準確率。并且該檢測法能夠減少樣本的投入量，在一定程度上還具有較高的經濟效益，在檢測過程中可以直接對多個基因進行檢測。

2.3 PR-PCR檢測法

PR-PCR檢測是PCR檢測法的一種變形，其與常規檢測法存在一定的區別，但是在食品微生物檢測工作中卻具有一定的優勢。該方法的檢測原理主要是提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用01igo（dT）或隨機引物，利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。該檢測法與常規檢測法的區別在于將檢測目標中的一條RNA先進行逆轉錄得到與之互補的DNA，并以此目標為基礎進行后期的復制和擴增。在該技術實施中，需要重點注意的是所逆轉錄的DNA模板必須是完整的，并且不含有蛋白質或者是其他雜質，這條基因鏈必須完整。在后期的微生物檢測工作開展中，可以用于微生物檢測的定量分析，如將熒光技術與數字技術結合的PCR檢測，通過將所測定目標中的微生物進行定量的方式進行相關檢測，能夠確保檢測過程具有較高的靈敏性，檢測結果更加準確。在實際食品微生物檢測工作開展中，運用PR-PCR檢測法，能夠具有針對性地檢測微生物，可以確保檢測結果的精準度更高。

3 PCR技術在食品微生物檢測中的應用

PCR技術目前已經廣泛應用到食物、水源的檢測中，其在微生物檢測中占有重要的地位。

3.1 用于食品致病菌的檢測

傳統的食品微生物檢測手段十分落后，不僅檢測過程煩瑣，而且檢測的準確率難以得到保障。在傳統的檢測手段下進行食品微生物檢測，需要對被檢測的微生物進行富集培養，當其數量在樣品中達到可檢測水平后才能夠進行微生物分離，并對微生物的形態特征等進行鑒定。該種檢測模式不僅需要人工培養微生物，在培養的過程中還容易出現各種突發情況，導致所培養的微生物并不能夠用于檢測。但相比之下，PCR檢測方式就有著較大的突破，PCR檢測方式能夠針對細菌中的編碼rRNA進行擴增和復制，通過擴增方式得到所需要的DNA片段，并通過片段檢測的方式，能夠高效便捷地獲得致病菌的存在情況[4]。另外，PCR檢測方式還能夠將人工無法培養的或培養效果較差的微生物，采用擴增的方式獲取DNA片段，彌補傳統檢測手段中的諸多不足。

3.2 用于生活飲用水中指示細菌的檢測

水質是影響人們健康的又一重要影響因素，除了食物安全以外，水質的檢測同樣十分重要。水質的檢測是以檢測大腸桿菌和人類糞便中污染的大腸桿菌為檢測指標。傳統的檢測方法煩瑣，需花費幾天的時間。若根據大腸桿菌能夠利用β-半乳糖苷酶，采用明確的底物進行檢測，則可以更加迅速地檢測到大腸桿菌。然而有一些大腸桿菌品系并不表達β-葡萄糖醛酸苷酶，因此偶爾也會出現檢測失敗[5]。而PCR技術為檢測β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸苷酶基因提供了一個更加靈敏和特異性更強的方法，并且在檢測的過程中還能夠通過擴增的方式對多種大腸桿菌的類型進行檢測，可以在更短的時間內完成更高質量的檢測。

3.3 用于乳酸菌的檢測與鑒定

以雙歧桿菌為例，P.KAUFMANN等人比較了雙歧桿菌現有的32個種及相關種的16S rRNA基因序列后，發現在其1 412～1 432位的寡核苷酸堿基序列（21個）在所有的雙歧桿菌中相同，能作為雙歧桿菌屬特異的寡核苷酸片斷，可用其作為PCR的引物來擴增雙歧桿菌16S rRNA的基因片斷。而模板DNA通過簡單的SDS裂解菌體細胞，而后用蛋白酶K去除蛋白即可獲得。在此條件下，所有的雙歧桿菌可由PCR擴增產生典型的1.35 kb的核苷酸片斷，而其他細菌則不產生此帶，故以此作為檢測基礎，實現對乳酸菌種類及數量的檢測與鑒定。

4 PCR技術的發展方向

PCR技術在目前主要應用于食品中微生物的檢測，在后期的發展中，PCR技術主要朝著3個方向發展，分別是不斷完善與提高DNA的模板純度、解決檢測中假陽性問題和與數字技術進行緊密結合。PCR技術在未來的發展中，會主要以上述3個發展方向為主，并且在后期會充分與數字技術相結合，實現更高效的食品微生物檢測。

5 結語

食物微生物檢測直接影響到食品安全，目前使用的PCR檢測技術，在進行實際檢測中有著一定的優勢。在后期的發展中，該技術也會在食品微生物檢測中逐漸普及與覆蓋，并且會與數字技術進行緊密結合，促進食品衛生檢測的高質量發展。