微生物檢測技術(shù)在食品安全檢測中的運(yùn)用

◎ 王麗萍，王東銘，張躍鳴，徐明揚(yáng)，秦蕓樺

（浙江公正檢驗中心有限公司，浙江 杭州 311305）

近年來，我國市場上的食品種類越來越多，滿足了人們各種食用要求，但食品市場的爆發(fā)也帶來了食品安全威脅，給行業(yè)監(jiān)管帶來了巨大的工作壓力。隨著人們對食品安全問題的日漸重視，各個食品生產(chǎn)廠家在食品生產(chǎn)的過程中，需要加強(qiáng)食品安全檢測，通過微生物檢測等技術(shù)對食品進(jìn)行全面把關(guān)，判定食品是否存在安全問題，實現(xiàn)規(guī)范、安全生產(chǎn)，提高企業(yè)在市場上的公信力和影響力。

1 食品微生物檢測內(nèi)容

1.1 食品污染程度檢測

在食品安全檢測方面，利用微生物檢測技術(shù)開展安全檢測時，應(yīng)重視食品污染程度檢測。菌落總數(shù)是食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每g或每mL檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)，是判定食品污染程度的標(biāo)志。大腸菌群是在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。針對這一檢測內(nèi)容，一般可采用MPN法和VRBA平板計數(shù)法，可以根據(jù)檢測結(jié)果來分析食品糞便的污染程度，獲得準(zhǔn)確的食品安全性評價結(jié)果[1]。

1.2 食品內(nèi)的致病菌檢測

現(xiàn)行的食品安全法律法規(guī)明確規(guī)定了食品中微生物的限量值，一旦超出了這一限量值，食品安全將難以保障。在開展食品安全檢測時，除了要進(jìn)行污染程度的檢測，更需要進(jìn)行致病菌檢測。食品中的致病菌并非只有一種，在開展檢測工作時要根據(jù)致病菌類型來進(jìn)行檢測方法的選擇，比如，很多食品在檢測時，都會將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌作為重點的致病菌檢測對象。我國食品中沙門氏菌的限量值為不得檢出，金黃色葡萄球菌的限量值為n=5，c=1，m=100，M=1 000，即同一批次的5個樣品中金黃色葡萄球菌的含量≤100 CFU·g-1，或有1個樣品金黃色葡萄球菌的含量在100～1 000 CFU·g-1，則該批次樣品合格；若有1個以上樣品金黃色葡萄球菌的含量在100～1 000 CFU·g-1或有任一樣品的金黃色葡萄球菌的含量大于1 000 CFU·g-1，該批次樣品不合格。雖然國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中的蠟樣芽胞桿菌未作要求，但當(dāng)食品中蠟樣芽胞桿菌總量處于108～109CFU·g-1時，也可能出現(xiàn)食物中毒。因此，任何類型的食品安全檢測中，都要重視致病菌檢測。

2 微生物檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

2.1 基因探針技術(shù)

基因探針技術(shù)屬于微生物檢測技術(shù)中的一種，是利用同位素、生物素等來進(jìn)行已知序列核苷酸的檢測。其檢測實現(xiàn)了分子雜交技術(shù)與目的基因的高度結(jié)合，在二者高度結(jié)合的條件下，也就同步產(chǎn)生了雜交信號，借助于這些信號就可以進(jìn)行相應(yīng)的基因識別。根據(jù)當(dāng)下的技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，基因探針技術(shù)下的基因探針標(biāo)記尤為重要，具體包含了同位素標(biāo)記和非同位素標(biāo)記兩種方法。使用同位素標(biāo)記方法，特異性相對突出，可在極短的時間內(nèi)得到食品中病原微生物的信息，但同位素標(biāo)記檢測也存在著一定的不足，表現(xiàn)為：當(dāng)進(jìn)行同位素標(biāo)記時，可能會出現(xiàn)一定的放射性污染，這些污染產(chǎn)物對人體的危害較大；同位素基因探針下的半衰期相對較短，需在檢測的同時進(jìn)行對應(yīng)的安全處理；紫外線照射后極易出現(xiàn)分解現(xiàn)象，干擾正常的檢測工作；標(biāo)本中的內(nèi)源性生物蛋白質(zhì)與其他糖蛋白可能會導(dǎo)致背景加深、非特異性反應(yīng)[2]。而非同位素標(biāo)記卻恰好可以解決同位素標(biāo)記中的這些問題，在利用基因探針技術(shù)開展檢測工作時，可根據(jù)檢測對象的特點選擇標(biāo)記的類型。

2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

當(dāng)下的食品安全檢測工作開展時，基因探針技術(shù)的應(yīng)用范圍廣，但使用該技術(shù)開展檢測工作時，每檢測一種菌就需要一種探針，雖存在檢測效率方面的優(yōu)勢，但因為檢測量大，需要對大量的樣品進(jìn)行培養(yǎng)，樣品培養(yǎng)增大了檢測處理難度，使其推廣應(yīng)用存在一定的限制。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的出現(xiàn)突破了樣品培養(yǎng)的限制，可經(jīng)由擴(kuò)增DNA或者增加檢測樣品中的核苷酸片段來獲得對應(yīng)的檢測結(jié)果，其檢測的技術(shù)原理為：在加熱處理下，雙鏈DNA可被裂解為兩條單鏈DNA，形成DNA聚合酶模板，在此基礎(chǔ)上進(jìn)入降溫處理環(huán)節(jié)，將前期所得到的核苷酸引物與DNA分子的互補(bǔ)序列依次實施退火和升溫處理，在這些處理工序下，酶促延伸引物和DNA可以直接配對形成新的模板，最后開展多次加熱處理，進(jìn)入退火與延伸的循環(huán)階段。通常情況下，退火溫度越高，擴(kuò)增的特異性越理想，所合成的DNA片段越大，也就意味著在合成過程中需要更多的時間。在每一次循環(huán)流程結(jié)束后，靶向DNA可擴(kuò)增一倍，在循環(huán)40次以后基本可達(dá)到100萬倍的擴(kuò)增目標(biāo)。在擴(kuò)增結(jié)束以后，經(jīng)由凝膠電泳、紫外核酸檢測儀來進(jìn)行DNA擴(kuò)增結(jié)果的全面檢測，得到相應(yīng)的檢測結(jié)果。

2.3 生物傳感器技術(shù)

在利用生物傳感器技術(shù)開展食品安全檢測工作時，為得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，需將抗體、核酸、多糖化合物等生物受體復(fù)合物與物理化學(xué)傳感器進(jìn)行有效連接，這些不同要素相互連接后，抗原與抗體之間會發(fā)生明顯的相互作用，對特異性生物情況進(jìn)行觀測就可識別異常情況。復(fù)雜樣品的生物光譜、過敏反應(yīng)等可利用生物傳感器技術(shù)來判斷；對檢測結(jié)果進(jìn)行分析可確定微生物種類、耐藥性等信息[3]。目前，很多生物傳感器都獲得了商業(yè)上的成功，如發(fā)酵傳感器、微生物傳感器、細(xì)胞傳感器等，在未來的生物傳感器技術(shù)發(fā)展中，應(yīng)加大在微生物敏感性方面的技術(shù)創(chuàng)新。

2.4 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)在食品安全檢測方面也十分有效，被稱為DNA微陣列技術(shù)，在利用這一技術(shù)開展相應(yīng)的檢測工作時，需構(gòu)建對應(yīng)的微點陣列，該陣列是在預(yù)定位置上固定的固相載體上的多個核酸分子所形成的，這些核酸分子的面積非常小。在食品安全檢測中，要發(fā)揮生物芯片技術(shù)的優(yōu)勢，需進(jìn)行核酸片段的標(biāo)記，在特定的環(huán)境條件下，確保互補(bǔ)核酸片段可以與載體上的核酸分子進(jìn)一步雜交，經(jīng)由所配備的芯片閱讀儀，可在對雜交信號分析的基礎(chǔ)上得到關(guān)于食品安全的對應(yīng)結(jié)果[4]。從本質(zhì)來看，生物芯片技術(shù)為雜交技術(shù)，這一技術(shù)具有高度的集成化特征，克服了傳統(tǒng)雜交技術(shù)在檢測方面的諸多限制，雖然具有自動化的特點，但因為芯片制作和樣品標(biāo)記中需注意的要點較多，使其在一些食品安全檢測時存在一定的限制。

2.5 免疫學(xué)技術(shù)

食品安全檢測中的免疫學(xué)技術(shù)包含了多種的技術(shù)，主要包括以下2種：①免疫熒光技術(shù)。在抗原或者抗體上進(jìn)行具有熒光的色素標(biāo)記，而這些色素不會對該抗原或者抗體產(chǎn)生任何的干擾，在標(biāo)記以后，這些色素就會與對應(yīng)的抗原或者抗體進(jìn)行有效結(jié)合，利用熒光顯微鏡就可以進(jìn)行特異性熒光反應(yīng)的觀測。沙門氏菌、葡萄菌毒素、單核細(xì)胞李斯特氏菌等的檢測中，免疫熒光技術(shù)的優(yōu)勢較明顯。此技術(shù)雖具有檢測速率高的優(yōu)勢，但操作流程繁多。②酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)。在固相載體上進(jìn)行抗體或者抗原的吸附，隨后開展免疫酶染色，底物染色以后，對有色底物開展定量化分析，就可以得到待測物質(zhì)的含量。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)結(jié)合了免疫熒光與放射免疫的優(yōu)勢，兼具高效性、可定量分析、標(biāo)記物穩(wěn)定方面的優(yōu)勢，在雜色曲霉、白地霉等的檢測中十分有效。

2.6 生理生化產(chǎn)物檢測技術(shù)

生物生化產(chǎn)物檢測技術(shù)主要有以下幾方面的技術(shù)：①電阻抗技術(shù)。細(xì)菌處于不斷生長的階段，大分子物質(zhì)可逐步在此過程中降解為活躍帶電小分子，經(jīng)由對阻抗電變化微弱程度的檢測，就可以獲得關(guān)于細(xì)菌數(shù)量的信息。這一檢測技術(shù)靈活性高，便捷性強(qiáng)。②微熱量技術(shù)。細(xì)菌在生長時伴隨著一定的熱量產(chǎn)生，通過對熱量變化規(guī)律的掌握，就可以進(jìn)行細(xì)菌的識別與鑒定，因為不同類型的細(xì)菌在生長時產(chǎn)生的熱量也有各自的特點，利用這一檢測技術(shù)的成本投入較低，可在短時間內(nèi)快速得出檢測結(jié)果[5]。③放射檢測法。細(xì)菌生長時，碳水化合物可被分解產(chǎn)生二氧化碳，對碳水化合物分子進(jìn)行放射性標(biāo)記后，直接通過對細(xì)菌生長階段的二氧化碳檢測，就可以得到細(xì)菌檢測結(jié)果。

2.7 現(xiàn)代化儀器檢測技術(shù)

隨著人們對食品安全問題的日漸關(guān)注，很多現(xiàn)代化檢測儀器逐步被應(yīng)用到了檢測工作中，主要為：①紅外線光譜檢測技術(shù)。對致病菌進(jìn)行近紅外光譜的掃描，獲得細(xì)胞壁的組成成分、生物分子結(jié)構(gòu)等信息，在此基礎(chǔ)上分離出致病菌的特異性光譜帶，建立細(xì)菌紅外光譜數(shù)據(jù)庫，通過檢索數(shù)據(jù)庫的方式快速得到食品中致病菌信息。②流動細(xì)胞技術(shù)。借助于流式細(xì)胞儀來完成對致病菌的細(xì)胞懸液的檢測，所得到的熒光濃度與DNA片段的大小有著一定的關(guān)系，實現(xiàn)致病菌絕對計數(shù)。

3 結(jié)語

當(dāng)下食品行業(yè)雖發(fā)展迅速，但食品安全問題時有發(fā)生，國家在食品安全監(jiān)管方面的投入刺激了食品安全檢測技術(shù)的發(fā)展，微生物檢測技術(shù)的類型多樣，技術(shù)先進(jìn)性明顯，為利用微生物檢測技術(shù)得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，應(yīng)根據(jù)食品特性來進(jìn)行對應(yīng)的檢測技術(shù)選擇和應(yīng)用。