食品中菌落總數能力驗證的結果分析與質量控制探討

◎ 盧福榮，李 杰，邵 悅，高 陽

（1.營口市食品藥品檢驗檢測中心，遼寧 營口 115000；2.歐陸食品檢測服務（大連）有限公司，遼寧 大連 116023）

菌落總數是指食品檢樣經過處理，在一定條件下培養后所得1 g或1 mL檢樣中所含細菌菌落的總數。它可以反映食品的新鮮度、被細菌污染的程度、生產過程中食品是否變質和食品生產的一般衛生狀況等。在歷年國家監督抽檢工作中，不合格的微生物指標主要是菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母菌的污染[1]。菌落總數項目的檢測包括多種產品類別，如糕點、飲料、乳制品及肉制品等，長期食用菌落總數超標的食品對人體健康會產生危害[2]。因此，食品中菌落總數的測定具有重要意義，不僅能為深入研究奠定理論基礎，同時也為后續實驗提供參考。

能力驗證是利用實驗室間對比，按照預先制定的準則評價參加者的能力[3]，能力驗證也是實驗室質量管理運行中風險管理和質量持續改進的方式之一[4]。營口市食品藥品檢驗檢測中心微生物檢驗室2020年參加中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的食品中菌落總數的檢測能力驗證，對2份待測樣品進行了稀釋、培養、計數，取得結果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 測試樣品

樣品1：由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供，食品中菌落總數的檢測能力驗證ACAS-PT89（2020），樣品編號：20-D980。

樣品2：由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供，食品中菌落總數的檢測能力驗證ACAS-PT89（2020），樣品編號：20-R172。

1.2 試劑及培養基

氯化鈉，批號：20190515，規格：500 g/瓶，國藥集團化學試劑有限公司；平板計數瓊脂，批號：1085235，規格：250 g/瓶，廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器，設備編號：2015-B3316，廠家：上海博訊實業有限公司；生化培養箱，備編號：150093，廠家：上海博訊實業有限公司；生物安全柜，設備編號：HR1500-IIA2，廠家：青島海爾生物醫療股份有限公司；可調移液器，型號：容量1 mL，容量10 mL；品牌：普蘭德公司。

1.4 檢驗方法

按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）[5]、能力驗證參試指導書進行檢測。

1.5 操作步驟

1.5.1 樣品前處理

按照參考說明指導，對樣品進行處理。將待測試樣品從冰箱中取出，恢復至常溫，在生物安全柜內將待測試樣品1的西林瓶打開，立即加入5 mL無菌生理鹽水進行再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，用余下的無菌生理鹽水清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，定容至60.0 mL，充分混勻，此溶液即是待測樣品原液。對樣品2處理方法相同。

1.5.2 樣品稀釋

按照GB 4789.2—2016中“樣品的稀釋”要求對兩份樣品分別進行稀釋，用無菌吸管吸取25 mL樣品勻液注入225 mL 0.85%生理鹽水稀釋液中，旋渦充分混勻，再吸取1 mL注入9 mL稀釋液中，逐級稀釋，制成10倍系列稀釋的樣品勻液，即10-1～10-5。

1.5.3 樣品培養

將樣品原液和各稀釋度樣品勻液各取1 mL注入無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。及時將冷卻至46 ℃的平板計數瓊脂培養基15～20 mL傾注平皿中，并轉動平皿使其混合均勻，待瓊脂凝固后再覆蓋一層培養基（約4 mL）。待凝固后，將平板翻轉，于（36±1）℃下培養48 h。

1.5.4 計數與報告

按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）中的標準要求進行計數和結果報告。

2 結果與分析

2.1 樣品檢測結果分析

樣品計數結果及結果報告見表1。對樣品1選取原液進行結果計算，選取原液、10-1及10-2稀釋度，結果為220 CFU·mL-1；樣品2選取10-2稀釋度進行結果計算，選取 10-2、10-3及10-4稀釋度，結果為10 000 CFU·mL-1。

表1 樣品測試結果表

菌落計數結果與稀釋度倍數成反比，且同一稀釋度平行樣品間差異較小，表明實驗結果相對準確，空白對照無菌落生長，表明實驗過程無污染，實驗結果有效。

2.2 能力驗證結果分析

能力驗證結果見表2。能力驗證評價標準按照|Z|值進行評價，|Z|＜2.0為滿意結果；2.0＜|Z|＜3.0為可疑結果；|Z|≤3.0為不滿意（離群）結果。營口市食品藥品檢驗檢測中心微生物檢驗室兩組實驗結果|Z|值均小于2.0，且|Z|值較小，評價結果滿意。因此，營口市食品藥品檢驗檢測中心微生物檢驗室在菌落總數項目上檢測具有較好的檢測能力。

表2 能力驗證評價結果表

2.3 菌落總數檢測質量控制分析

本次菌落總數的能力驗證嚴格按照國標方法及操作指導書要求操作，并對實驗過程每個可能存在不確定度和風險的環節進行嚴格控制，如實驗備品滅菌情況、無菌操作、樣品液制備及稀釋、稀釋液吸取量、計數方面和溫濕度等，所得實驗結果較為理想。

2.3.1 實驗備品滅菌的控制

PCA培養基、0.85%生理鹽水、移液器、槍頭等所有實驗相關用品應嚴格按照要求，在121 ℃條件下高壓滅菌15 min，確保無菌狀態，避免對檢驗結果產生不良影響。

2.3.2 無菌操作的控制

嚴格按照無菌操作要求進行實驗，開始操作前實驗人員應戴好帽子、口罩、手套，防止樣品被污染，同時做好個人安全防護。樣品內可能含有致病菌，因此本實驗應在生物安全柜中進行操作，實驗前生物安全柜應紫外滅菌30 min，用75%乙醇擦拭實驗臺面及操作人員雙手，打開樣品西林瓶前同樣需用75%乙醇擦拭瓶蓋，確保實驗全過程為無菌操作。

2.3.3 樣品液制備的控制

①能力驗證的樣品為凍干粉裝，在樣品液的制備過程中，凍干粉應充分溶解。為了增加溶解性，將滅菌好的稀釋液（0.85%生理鹽水）放入46 ℃恒溫水浴鍋內保溫。②打開樣品西林瓶，加入5 mL無菌生理鹽水進行再水化時應用移液器反復吹打，使其充分混勻。③為避免氣溶膠的產生，應采用帶濾芯的槍頭，同時控制好吹打力度。④待溶解后，吸出放入無菌瓶中，用余下的無菌生理鹽水清洗西林瓶內壁，應多次反復沖洗，確保西林瓶內所有菌液都被收集。⑤定容要準確。

2.3.4 稀釋液吸取量的控制

樣品稀釋液含量會直接影響結果的準確性，應嚴格按照稀釋比例進行樣品的稀釋。高壓滅菌會使稀釋液的含量減少，因此，本實驗為避免稀釋液散失，采用滅菌后實驗前定量分裝。同時要正確使用移液器，確保吸取量準確。

2.3.5 計數瓊脂的控制

實驗室購買的PCA瓊脂培養基應有相應的質控報告，同一批次的培養基應按照GB 4789.28—2013標準要求進行驗收。①培養基溫度要控制在46 ℃左右，將配置好的PCA瓊脂培養基放置46 ℃恒溫水浴鍋中保溫，避免培養基溫度過高或過低影響實驗結果。②傾注培養基時應果斷迅速，控制在15 min內完成傾注，避免樣品稀釋液中微生物生長或失活，影響實驗結果。③傾注培養基旋轉混勻時，應向同一方向旋轉5次，然后反方向旋轉5次，旋轉時應注意防止混合物濺到平皿上方，影響實驗結果。④平皿傾注的厚度按要求為9 cm，培養皿應傾注15～20 mL培養基。

為防止培養后菌落蔓延，需在傾注完待瓊脂凝固后，加3～4 mL PCA瓊脂培養基覆蓋平皿表層，便于結果計數。傾注完成的培養基應倒置培養，倒置培養可防止培養水分蒸發時形成的冷凝水滴落在培養基上造成染菌，同時可防止菌落蔓延，有利于單菌落的形成，便于計數。

2.3.6 計數觀察控制

有研究表明，PCA直接傾注法菌落生長相對較快，培養24 h，菌落數已達到峰值，因此在培養24 h后應進行一次觀察計數，以防止菌落被覆蓋而影響到計數結果。

3 結論

本此實驗菌落總數測定的結果相對準確，符合檢驗標準要求及相關的質量要求，能夠為菌落總數檢測提供科學準確數據，為實驗室的持續運行提供了技術支撐，也能更好地為地方食品安全監管作出貢獻。

同時，能力驗證也是客觀的實驗室技術能力和管理水平的考核方法，是重要且有效的實驗室外部質量控制評估手段[3]。能力驗證不僅可以真實的反映出實驗室在項目檢驗中的水平，且可通過能力驗證的結果，分析該項目在檢驗過程中存在的問題，對不滿意結果進行“人、機、料、法、環”多方面分析，從而幫助實驗室解決可能存在的問題，并及時改進。