抗凍蛋白研究現狀及其在食品工業中的應用

◎ 趙明明

（山東省食品藥品審評認證中心，山東 濟南 250014）

隨著研究的逐步深入，人們對抗凍蛋白的結構、分類、特性及作用機理等方面進行了闡述。不同來源的抗凍蛋白具有不同的特性，為此，本文綜述了抗凍蛋白的來源、提純及其在食品工業的應用，為尋找抗凍蛋白的新來源，實現工業化生產提供參考。

1 抗凍蛋白的來源

目前，抗凍蛋白的研究已涉及多類生物，從研究對象分析，抗凍蛋白主要來源于魚類、昆蟲、植物[1]。魚類中的抗凍蛋白研究比較透徹，并已經將其基因轉入植物體內來降低植物凍害；昆蟲中抗凍蛋白的抗凍活性是魚類的10倍～100倍；植物中的抗凍蛋白具有顯著抑制冰晶形態的作用，但對植物中抗凍蛋白的研究較晚，依據相對較少。本文將從魚類、昆蟲、植物3大類來源進行簡述。

1.1 魚類中的抗凍蛋白

自20世紀60年代DEVRIES從比目魚血清中發現抗凍蛋白以來，不斷有科學家從其他極地魚類和冷水魚中發現抗凍蛋白[2]。抗凍蛋白主要來自于極地魚類和冷水魚類的血清和上皮組織中，魚類血清是從魚類獲取抗凍蛋白的主要來源。科學家們已從南極大頭鰻鱺、太平洋鯡魚等的血清中提取到不同類型的抗凍蛋白。根據已有研究[3]，目前從魚類中發現的抗凍蛋白主要有5大類，分別是抗凍糖蛋白、抗凍蛋白I、抗凍蛋白Ⅱ、抗凍蛋白Ⅲ和抗凍蛋白Ⅳ。

1.2 昆蟲中的抗凍蛋白

伴隨著魚類血清中不斷發現新的抗凍蛋白，研究者試圖從耐寒的昆蟲血淋巴中提取抗凍蛋白。1968年GRIMSAY首次證實黃粉甲幼蟲血淋巴中存在高活性的抗凍蛋白。之后又有學者不斷從不同昆蟲血淋巴中提取出抗凍蛋白。MOK YEE-FOONG從馬里恩島的17種節肢動物包括螨、蜘蛛、彈尾目、嚙蟲目及鞘翅目等的血清中分離到不同類型的抗凍蛋白。昆蟲血淋巴是探索分離新的昆蟲抗凍蛋白最常用的途徑之一，且在昆蟲中發現的抗凍蛋白多存在于越冬的昆蟲體內。目前，對以下4種昆蟲抗凍蛋白的研究最為廣泛，即黃粉蟲、美洲脊胸長椿、樅色卷蛾和甲蟲[4]。TOMALTY HEATHER E等已經開發了一種從實驗室飼養的冷馴化甲蟲幼蟲中產業化提取抗凍蛋白的方法。

1.3 植物中的抗凍蛋白

自1992年加拿大的GRIFFITH第1次明確提出獲得植物內源性抗凍蛋白以來，目前已研究了60多種植物體中抗凍蛋白的存在性，并在多種植物體中發現了抗凍蛋白[5]，如野生香蕉、沙冬青、冬油菜等。抗凍蛋白多存在于耐寒植物體中，在不同組織均有發現。在不同生物體或同一生物體的不同組織中抗凍蛋白的存在和活性是不一樣的。目前，對植物抗凍蛋白的研究雖然有所進展，但對植物體內具體抗凍蛋白的理化特性、類型及具體的作用機制還不太清楚。下一步，從不同植物體內提取內源性抗凍蛋白，并對其類型、結構進行分析是研究的重點。

2 抗凍蛋白的分離純化方法

分離純化出抗凍蛋白是確定抗凍蛋白來源，進一步工業化生產抗凍蛋白的前提。目前，人們已在魚類、昆蟲、植物、細菌和真菌體內發現了多種抗凍蛋白，部分已采用基因工程，將提取出的抗凍蛋白基因進行表達，導入生物體內組織培養，進而實現產業化生產。現對抗凍蛋白分離純化常用方法進行闡述。

2.1 傳統的分離純化方法

傳統的分離純化方法主要根據蛋白質分子量、所帶電荷、等電點和親水性等性質的差異進行分離。常用的技術有離子交換層析、凝膠層析、等電聚焦、疏水層析及高效液相色譜等方法，在實際操作中一般將幾種技術聯合使用。

其一般步驟以DEBORAH J. SIMPSON等[6]分離抗凍蛋白為例，取35 g樹皮在液氮下搗碎→加熱煮沸15 min→紗布過濾，在4 ℃、20 000 g、離心15 min獲上清→通過探索確定Q-sepharose層析的緩沖液pH=7→洗脫并收集有活性的成分→4 ℃對磷酸緩沖液（pH=7）透析過夜→透析液上羥基磷灰石柱子，1 M磷酸緩沖液（pH=7）、1 mL·min-1洗脫→收集有活性成分，超濾濃縮→上Superdex75，50 mmol Tris-hcl（pH=7），1 mL·min-1洗脫→收集有活性成分SDS-PAGE分析為單一蛋白。

通過分析發現，植物中的抗凍蛋白一般具有熱穩定性，可以根據這一特性在抗凍蛋白分離過程中加入熱處理，以除去雜質蛋白，利于后續純化。傳統分離方法存在分離周期長、過程復雜、收率低、分離過程不穩定及重現性差等缺點。

2.2 冰吸附法分離純化抗凍蛋白

抗凍蛋白具有吸附到冰晶表面并修飾冰晶形態的特性，科學家嘗試利用碎冰來提取抗凍蛋白。2003年KUIPER設計一套冰手指裝置，通過降溫吸附蛋白，成功純化出抗凍蛋白Ⅲ。2010年，CAI等[7]把碎冰加入到女貞葉粗提液中直接冰提抗凍蛋白，并探討了冰提時間和用冰量對抗凍蛋白提取的影響，最終獲得了4種抗凍蛋白。冰特異性吸附分離法利用抗凍蛋白對冰的特殊吸附，一步分離后可顯著提高抗凍蛋白的純化倍數，比傳統的色譜法更快、更有效。但這種方法需對純化過程進行嚴格控制，且分離裝置較為復雜。隨著目前蛋白質純化設備的發展和改進，該方法具有廣闊的應用前景。

2.3 SDS-PAGE分離純化抗凍蛋白

HON等[8]采用單一的SDS-PAGE法從冬小麥中獲得7個主要的抗凍蛋白多肽，其中的5個分子量為19、26、32、34及36的多肽顯示出高抗凍活性。其操作步驟為：冬小麥預處理→95 ℃處理5 min→上12%的SDS-PAGE→電泳跑完后將膠壓碎，用50 mmol Tris-HCL（pH=8）和0.1%SDS洗提多次→進行離心去除膠，得上清→加入4倍上清體積的預冷乙醇處理→得沉淀溶解與10 μL的0.1 M NH4HCO3，獲得0.6 mg抗凍蛋白。這一方法是已知文獻中獲得抗凍蛋白最簡便的方法。

3 抗凍蛋白在食品中的應用

抗凍蛋白因其安全且能有效抑制冰晶重結晶的能力，在食品的冷凍冷藏中具有廣泛的應用前景，能有效抑制冰晶生長，減少營養成分的損失，保證食品品質。

目前，已有學者成功將抗凍蛋白應用到冷凍豬肉、冷凍面團、冰淇淋及果蔬保鮮中。冰淇淋是食品工業領域中抗凍蛋白應用最為成功的案例。ZHANG等[9]向冰淇淋中加入0.1%抗凍蛋白，提高了冰淇淋的再結晶性和耐熔化性。此外，0.1%抗凍蛋白的加入使冰淇淋的玻璃化轉變溫度由-29.14 ℃提高到-27.74 ℃。

4 結語

抗凍蛋白雖然顯示了其在食品工業中的廣泛應用前景，但仍存在成本較高、不易產業化等特點。因而分離純化出不同來源的抗凍蛋白，并對其結構、基因序列進行分析，是產業化生產的前提。分離純化出高活性的抗凍蛋白并對其進行基因重組、克隆是下一步研究的重點。