林木基因工程的研究進展

于洋，尹琦，于爽*

(1.牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157000；2.昆明理工大學醫學院，昆明 650000)

森林作為陸地生態系統的構成主體，它直接關系到在這個地球生活上的所有生物，與人類更是有著無法分割的聯系，具有極大的生態重要性和經濟效應。林木遺傳育種在林業發展上是永恒的話題，常規育種的周期性較長是林木遺傳育種的瓶頸問題。1983年，科學家首次完成了對植物的遺傳改造，使加速植物育種成為可能。1986年，抗除草劑轉基因楊樹的問世標志著林木基因工程的誕生，迄今為止，已有幾十種林木獲得遺傳轉化[1]。

1 林木遺傳轉化的方法

理論上基因工程的遺傳轉化方法共有十多種，但在林木中實際使用最為廣泛的就是農桿菌介導法和基因槍法，其次是花粉管通道法和電穿孔法。

1.1 農桿菌介導法

農桿菌介導法是將所需的目的基因插入Ti質粒的T-DNA中，再利用農桿菌侵染植株將T-DNA插入到植物基因組中，使目的基因高效表達。農桿菌介導法不僅價格低廉，而且具有基因沉默現象少、轉育周期短和重復性好等優點，這使其成為現代遺傳轉化中實用性最強的主導方式。

Nishitani等將目的基因PDS用農桿菌介導法轉化蘋果，獲得的轉基因蘋果白化表型與類胡蘿卜素含量均降低[2]；伍寧豐等選取中國南方楊樹N1069為受體材料，利用葉盤法將昆蟲特異性神經蝎毒素AaIT基因轉化至受體中，轉基因楊對舞毒蛾幼蟲有明顯的抗性，致死率顯著高于未轉基因對照植株[3]；饒紅宇等通過根癌農桿菌介導將Bt毒蛋白基因轉入楊樹NL-80106，在諸多轉化株中，B45和B64對一齡舞毒蛾幼蟲有明顯抗性，轉基因楊樹葉片的幼蟲致死率顯著高于對照[4]。

1.2 基因槍法

基因槍法是將目的基因的遺傳片段依附在高速微彈上，利用物理原理通過高速發射直接使目的基因導入受體細胞或者受體組織中。基因槍法對于目的基因的宿主選擇并無限制，且由于微彈的特殊性，使目的基因的受體作用類型覆蓋面相當大。喬利亞等利用基因槍法將Bt基因轉入楊樹，并獲得了抗蟲效果明顯的轉基因歐洲黑楊[5]；李玲等在對歐洲黑楊的研究中，使用基因槍法導入Barnase基因，最終得到了理想轉基因植株[6]；崔旭東用基因槍法將多種抗寒基因和多種功能基因同時整合到歐美楊渤豐1號染色體的遠端，最終培育出理想的強抗旱轉基因楊樹[7]。

1.3 花粉管通道法

花粉管通道法原理是當植株子房成功授粉后，通過在其內注入含有目的基因序列的核酸，當子房開始開花受精時，植株會出現花粉管通道，所導入的核酸就通過花粉管通道將目的基因導入受精細胞中，使外源基因被整合到受精卵基因組中得以表達，從而得到新的轉基因個體。

花粉管通道法不同于其他分子層面的拼接技術，整個過程較為簡便，且對實驗環境要求不高，只要是開花的單子葉或雙子葉林木，無論是多胚還是單胚都可以使用種質轉化方式，并且可以直接將DNA重組分子導入。通過種質轉化方式來進行遺傳轉化只能在開花植物的花期進行，而且需要大規模群體化轉育。為了提高花粉管通道法在核桃中的轉化率，師校欣等用“清香”核桃做材料，采用切割柱頭滴加法、直接滴加法、子房注射法等方式，分別研究了外源基因導入受體所需要的時間、基因溶液的最適濃度和導入方式對效率的影響[8]。

1.4 電擊法

細胞在經過瞬時間數千伏特的高壓電的作用下，細胞膜發生去極化，會產生一個20～40 mm的瞬間微孔，當微孔產生時，存在在懸液中的外源核酸從細胞膜上的微孔進入，與細胞內的受體細胞基因整合的過程叫做電擊法。電擊法操作簡便，且作用效果直接高效，自從選用磁性納米顆粒作為外源基因的DNA載體后，其轉化效率也變得更高。

McCown 等利用電擊法將外源基因與Bt基因融合并導入雜種楊中，使轉基因植株產生了對鱗翅目昆蟲的抗性[9]；Liu等利用電擊法將Bt基因導入華山松中，證明了當電擊的受體為成熟的體細胞胚時，更加有利于外源基因的整合[10]。

2 林木基因工程的應用

2.1 植物修復

工業的迅速發展不僅對土壤和水資源帶來了難以恢復的損傷，遺留的污染物更是給如今的人們留下了大大的難題，并且還存在化學殺蟲劑殘留所導致的極端土質等問題。上世紀八十年代起運用植物處理污染物的設想首次被提出，污染物治理的方法便開始由物理化學手段向植物修復手段進行轉移，這也為林木應用提供了一個育種方向。

柴文嫻獲得的轉MT基因的南林895楊樹既可以給具有揮發性的化學農藥所釋放的碳氫化合物解毒，還能夠吸收土質中的重金屬元素[11]，是目前退耕還林和礦區種植的首選樹種類型。Rugh 等獲得的改良汞還原酶(MerA)基因的轉基因黃楊可以使高毒的離子汞Hg(II)轉化為毒性低毒的元素汞Hg(O)[12]。

2.2 抗病蟲害應用

在林木漫長的生長期過程中病蟲害會導致林木生長受到抑制，降低林木存活率，從而造成森林面積的減少。現今由于人工林的樹種單一，且由無抗性純林組成，使其更容易被病蟲侵害。隨著林木基因工程的發展，林木抗病蟲害育種方面已有相當廣泛和突出的應用。

黃艷等將球孢白僵菌中的幾丁質酶基因轉入毛白楊中獲得了抗病轉基因株系[13]。自饒紅宇等獲得抗蟲歐洲黑楊后，又相繼有抗舞毒蛾和天幕毛蟲的轉基因雜種楊[14]、抗食葉昆蟲的轉基因楊[15]和抗鞘翅目昆蟲的741楊等問世[16]。

2.3 抗逆改質

通過轉基因技術拓寬林木生境、拯救極端環境的植物缺乏和改良林木品質，一直是國內外林木育種研究中的熱點，現已有諸多報道。

在抗逆方面，繼我國育成首例大田生產的抗鹽堿轉基因楊樹—中天楊[17-18]后，楊春霞、姜超強等也相繼獲得了抗旱耐鹽的轉基因楊樹[19-20]；Arisi等獲得了抗凍性顯著提升的轉基因楊[21]。

在品質改良領域，白爽將檉柳lea基因導入小黑楊，結果顯示轉基因楊光合效率更高[22]，姜超強將AtNHX1基因轉入歐美107楊中，也獲得了光合作用效率更高的轉基因植株[23]；張國壁通過轉AlaAT(丙氨酸氨基轉移酶)基因提高了小黑楊固氮效率[24]；Hu等將輔酶A連接酶(4cl)基因轉入美洲山楊，轉基因楊木質素下降了45%，且纖維素增加了15%[25]；Weigel 等將擬南芥Leafy基因轉入楊樹中得到轉基因楊，結果表明轉基因楊的花期明顯提前[26]；何業華等將番茄ACC合成酶反義基因導入不同的棗類品種，最終獲得耐儲存轉基因棗類品種[27]。

3 林木基因工程展望

森林作為生態環境和經濟發展的重要一環，所能創造的生態效益和經濟價值是非常巨大的。總體看來，林木基因工程具有非常廣闊的發展空間，當前林木基因工程正處于前人開疆，后人擴土的絕佳發展層面，要保持充分的投入，才會保證發展的可持續性。

轉基因技術應用于林木遺傳改良已有幾十年的歷史，但還存在一些技術問題有待解決，如常用轉化手段的轉化效率問題、個別樹種轉基因體系建立的問題等。此外，轉基因物種的安全性問題也不容回避，甚至關乎林木基因工程的未來發展和可行性。