食品安全檢測中微生物檢測技術與應用探究

◎ 李 兵

（諸城市檢驗檢測中心，山東 諸城 262200）

食品安全關系到人們的身體健康，近年來，“瘦肉精”“毒奶粉”“地溝油”“僵尸肉”等食品安全事故，引起了社會的廣泛關注。國家加大了食品安全監管力度，修訂的《國家食品安全監督抽檢實施細則（2021年版）》對糧食加工品、食用油、油脂及其制品、調味品、飲料及肉制品等食品的微生物檢驗作出了明確的規定，抽樣檢測的數量、樣品保存、運輸以及檢驗要求作出詳細的規范。通過食品微生物檢測技術，可以了解食物中微生物的種類、數量，判斷食品加工過程和食品衛生狀況，以此作為衡量食品衛生健康的重要參考指標。由于食品生產加工工藝復雜，食品在生產、運輸、存儲、銷售等各個環節容易受到微生物的污染，造成食品微生物中的數量超標。人體長期使用微生物超標的食物，容易出現食物中毒、呼吸道和腸道疾病。通過微生物檢測技術可以及時發現食品中的微生物成分，為食品藥品監督管理部門提供參考，預防和防止食品安全事故的發生。

1 食品微生物檢測內容

微生物是肉眼無法辨別的細菌、真菌、病原體、支原體等生物體，這些生物個體比較小，具有高效的生物化學轉化能力，可以在短時間分解大量的能量，生長繁殖速度快，例如大腸桿菌在20 min內可以繁殖一次，適應能力比較強，容易發生變異。微生物與人們之間的關系密切，不良微生物容易造成人體疾病，如真菌感染容易引起皮膚病，放線菌容易造成皮膚、傷口感染、有毒細菌容易造成上呼吸道感染、食物中毒[1]。由于微生物的種類多，在特定條件下繁殖速度快，因此需要快速對食品微生物的成分和數量進行檢測。目前，國家衛生部頒布的微生物檢測的生物指標主要包括細菌群總數、大腸菌群、致病菌3項。菌落總數是指食品樣品在規定的環境下培養后，單位重量、容積上所生成的細菌菌落總數；大腸菌群主要指埃希氏菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬等腸桿菌類，這些大腸菌群主要來自人體或者動物的腸道，主要寄宿在人體或者動物的腸道內，容易誘發腸道疾病。如果檢測樣品的大腸菌群多，則表明這些食品受到污染程度越大，所以將其作為污染食品的衛生指標之一[2]。致病菌主要指食品中含有令人致病的細菌，如果大腸桿菌群檢測數量為陽性，則需要檢查食品中的致病菌。根據國家食品衛生相關標準，致病菌包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、致病性鏈球菌、志賀氏菌4種。正常情況下，食品中不允許檢測出致病菌，在檢測過程中，必須根據食品種類和環境，選擇相應的菌群進行檢驗。米、糧、苗等食品主要將變形桿菌、霉菌、芽孢桿菌等作為檢測菌群；海產品則將副溶血性弧菌作為檢測參考菌群；罐頭食品需要檢測耐熱性芽孢菌群[3]。

2 食品安全檢測中微生物檢測技術

2.1 熒光抗體檢測技術

熒光抗體檢測技術是用熒光物標記抗體檢測細胞中或者組織結構中相關抗原體或者抗體的一種技術。熒光類物體包括異硫氰酸熒光素、羅丹明熒光素等，測評方法是將被測樣品固定在玻璃片上，然后將熒光抗體添加在玻璃表面，用緩沖液進行沖洗，干燥后，在熒光顯微鏡下進行觀察，如果顯示為陽性則表示是可見帶熒光的抗原抗體；如果顯微鏡沒有看到熒光，則表示為陰性，說明帶熒光的抗體與抗原無法結合，被沖洗掉了。這種檢測技術操作簡單、敏感性低、檢測速度快，可同時檢測多種抗原體比較復雜的樣品[4]。目前，熒光抗體技術主要用于細菌、病菌、寄生蟲和免疫疾病等方面的診斷，通過測定血清中的抗體，診斷流行性病學，對布氏桿菌、炭疽桿菌、痢疾志賀菌等方面診斷效果比較可靠，一般用于補充診斷方式，不能作為常規診斷方式。

2.2 免疫酶技術

免疫酶技術是通過酶標記抗體或者抗原檢測食品種原有的抗體或抗原，是將抗原抗體反應的特異性和酶的催化性結合起來的一種檢測技術，它以酶作為標記物，連接抗體或抗原，酶與抗體發生作用下，通過底物顯示的顏色判斷出抗原抗體的數量，并通過酶標進行定量、定性分析。標記酶包括堿性磷酸酶、辣根過氧化酶等，這些酶與樣品中抗體和抗原反應后酶性能不會發生變化，不會影響到測定結果。常見的酶檢測技術包括間接法、夾心法，根據檢測對象，選擇不同的檢測方法。如果是檢查樣品的抗體，則選擇夾心法，將具有特異性的抗體吸附在聚乙烯材料的導管、小盤上，在里面加滿被測溶液，如果樣品中含有抗體，則抗體在導管、小盤上形成復合物，通過洗滌加入酶標記的抗體后，抗體結合到載體表面，清洗剩下的標記抗體，在抗體中加入酶，酶發生催化還原反應后產生有色物質，通過肉眼和分光光度計可以觀察有色產物和溶液抗原體；間接法主要運用在醫學血液檢查，食物微生物檢測應用比較少[5]。

2.3 基因探針技術

基因探針技術別稱分子雜交技術，是根據脫氧核糖核酸分子的變異性、復雜性和堿基互補配對的精確性，對某一組特異性的基因序列進行探查的技術，互補的脫氧核糖核酸單鏈在一定環境下可以形成雙鏈，并進行雜交。這種結合具有特異性，需要嚴格按照堿基互補配對的要求進行，不僅可以實現脫氧核糖核酸和脫氧核糖核酸的互補配對，而且還可以實現脫氧核糖核酸和核糖核酸之間的互補配對。通過對已知的核酸序列進行探針，如果變性的單鏈基因和脫氧核糖核酸結合，且堿基完全匹配的話，兩者可以結合成雙鏈，那么說明被測定樣品脫氧核糖核酸中含有已知的基因序列。如果分子雜交與目的檢測基因結合，形成雜交信號，則可以找到目的基因。基因探測技術需要利用同位素、生物素等標記的特定基因片段進行判定，同位素探針速度比較快，但是探針過程中，操作不當容易造成環境污染，因此，盡量選擇生物素進行探針。

2.4 生物芯片技術

生物芯片技術是通過縮微技術，按照分子間特異性相互作用的原理，將生命科學領域中不連續的分析過程集成于硅芯片或者玻璃芯片表面的微型生物化學分析系統，從而快速實現對細胞、蛋白質、基因或者其他生物成分進行檢測。生物芯片技術是采用光導原位合成或者微量點樣的方式，將核酸片段、多肽分子、組織切片和細胞等生物樣品按照要求固化在固體載體的表面，構成密集的二維分子排列，并與已經標記需要檢測的生物樣品進行分子雜交，然后用儀器設備檢測分子雜交信號的強度，從而快速分析分子的數量和種類。一般固體載體選擇硅片，在檢測過程中需要模擬計算機芯片制造條件，因此被稱之為生物芯片技術。生物芯片技術在檢測過程中，生物樣品的處理必須遵循相似方式，也就是信號的放大和樣品標記。蛋白芯片在檢測過程，可以將需要檢測的蛋白樣品用熒光素或者其他物質標記，再與生物芯片的生物分子相互作用，通過相應的檢測方法可以采集、分析樣品生物芯片的分子作用結果，從而快速判斷分析食品病原體、大腸桿菌數量等。

3 食品安全檢測中微生物檢測技術應用

大腸桿菌是一種致病菌，在一定條件下可以造成人體胃腸道、尿道、關節等多種局部組織器官的感染，對人體危害比較大。大腸桿菌是一種食源性致病菌，可以在小腸內產生大量毒素，造成出血性腸炎、溶血性尿毒癥并發癥，最終導致寄主死亡。食源性病毒檢測主要以傳統方法、免疫檢測方法和聚合酶鏈式反應法為主，由于細菌的選擇性，少量致病菌在大量非致病菌環境下可以共生，單純的聚合酶鏈式反應有助于目標基因的純化，但是需要耗費大量時間，通過生物芯片檢測技術可以快速發現樣品中的致病菌。生物芯片檢測技術靈敏度比較高，常規細菌只需要8 h的培養時間就可以進行檢測，30 min完成核酸提取，通過模擬計算機芯片計算模式，可以建立多重不對稱聚合酶鏈式反應，完成芯片雜交檢測。此外，多聚酶式反應技術可以檢測食品中的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。生物芯片技術在食品微生物檢測環節，不僅可以檢測食品中的致病菌，而且還可以檢測隱藏致病菌。

4 結語

微生物檢測技術在食品安全檢測中的具有檢測速度快、檢測效率高、靈敏度好等特點，可以快速檢測食品中大腸桿菌、總菌數和致病菌指標，但是目前我國的微生物檢測技術尚處于初步發展階段，相關技術并不成熟，無法進行大范圍的推廣應用，還需要進一步加快食品微生物技術檢測，進一步完善檢測系統，降低檢測成本。