冰凍人血清α-淀粉酶催化活性濃度候選二級標準物質的研制

王建兵，韓麗喬，林海標，張喬軒，嚴 君，莊俊華，黃憲章

（廣東省中醫院檢驗醫學部，廣東 廣州 510120）

血清、尿液α-淀粉酶測量是臨床上最常用的實驗室檢測指標之一，在胰腺疾病，特別是急性胰腺炎的診斷、療效觀察中具有重要作用。淀粉酶是急性胰腺炎早期診斷指標[1]，為解決臨床檢驗血清淀粉酶測量結果的正確性，實現測量結果的可溯源性和臨床檢驗結果可比、互認，減少重復檢查，減輕患者負擔，本實驗室制備了2個水平的冰凍人血清α-淀粉酶催化活性濃度候選二級標準物質。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

cobas 8000全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑、校準品和質控品，U-3310分光光度計（日本日立公司）。參考方法試劑：N-2-羥基乙基哌嗪-N'-乙基磺酸（批號為017K5410，美國Sigma公司），4，6-亞乙基-4-硝基苯-α-（1-＞4）-D-麥芽七糖（批號為121214A，北京阿匹斯公司）。有證參考物質IRMM/IFCC-456（歐盟參考物質和測量研究中心）。

1.2 標準物質樣本制備

選擇外觀清亮，無脂血、黃疸和溶血的樣本。乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋體抗體、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體檢測陰性。經2次除菌過濾后，分裝至無菌收集管中，每支1 mL，共300支。制備了2個水平的標準物質，可-70 ℃冰箱保存。

1.3 標準物質評價

按照JJF 1343—2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》和JJF 1644—2017《臨床酶學標準物質的研制》要求進行均勻性、穩定性、互換性評價[2-3]，所有樣本均采用cobas 8000全自動生化分析儀測量。

1.3.1 均勻性檢驗 取15支樣本，在1個批次內完成測量，每支樣本重復測量3次。結果采用單因素方差分析進行評價。方差分析結果中的組間方差MSamong＞組內方差MSwithin時，樣本間均勻性的標準偏差sbb計算公式為：

式中ubb，rel為α-淀粉酶由于樣本不均勻性引入的不確定度分量。

1.3.2 穩定性評價 采用同步穩定性進行評估，結果采用回歸分析的t檢驗進行評價，基本模型為：Y=β0+β1X，式中β1、β0為回歸系數，X為時間，Y為標準物質的特性值。（1）短期穩定性評價。評價運輸對標準物質待定特性值的影響。分別于第1、2、3天從冰箱中取出樣本，放入干冰冷凍包裝箱，與第5天從儲存冰箱中取出的樣本同時進行測量。每個水平1個監測點抽取2支樣本，4個監測點合計8支樣本。在1個批次內完成測量，每支樣本重復測量3次。（2）長期穩定性評價。評價標準物質-70 ℃保存1年的穩定性。分別于第0、7、31、90、182天從-70 ℃冰箱中取出樣本，放入液氮瓶中，與第365天從-70 ℃冰箱中取出的樣本同時進行測量。每個水平1個監測點抽取3支樣本，共6個監測點，合計18支樣本，在1個批次內完成測量，每支樣本重復測量3次。（3）使用時穩定性評價。評價標準物質使用時儲存于冰箱（2～8 ℃）或室溫（20～25 ℃）的穩定性。分別于24、6、4、2 h從-70 ℃冰箱中取出4支樣本，冰箱或室溫各放置2支，與測量前從-70 ℃冰箱中取出的樣本同時進行測量。每個水平1個監測點抽取4支樣本，冰箱或室溫環境各放置2支，進行穩定性檢驗，共5個監測點，合計20支樣本。在1個批次內完成測量，每支樣本重復測量3次。（4）穩定性引入的不確定度。由穩定性引入的不確定度計算公式為：us=s（β1）×X，式中us為由穩定性引入的不確定度，s（β1）為β1的標準偏差，X為給定的保存期限。

1.3.3 互換性評價 互換性采用最小二乘法進行線性回歸分析。（1）參比檢測系統。實驗室參照2006年國際檢驗醫學溯源性聯合委員會推薦的α-淀粉酶參考測量程序（37 ℃）[4]建立一級參考方法[5]。（2）臨床評價檢測系統。系統1：瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀及配套試劑（AMY384295）、校準品（cfas，lot：305596）和測量程序；系統2：美國貝克曼庫爾特公司AU5800全自動生化分析儀及配套試劑（AMY6159）、校準品（lot：F6662）和測量程序；系統3：瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀、深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司試劑（AMY 142819001）、校準品（059318006）和測量程序；系統4：瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀、四川邁克生物股份有限公司試劑（AMY0518061）、校準品（Lot：366059）和測量程序。（3）樣本。共20份新鮮單供體人血清樣本，濃度范圍覆蓋標準物質濃度范圍，每個樣本重復測量2次。

1.4 定值

1.4.1 定值方法 定值依據參考文獻[4-5]進行（同參比檢測系統）。2個水平的標準物質每日分別測量3次，連續測量3 d，共9個測量結果。

1.4.2 定值方式 由6家通過中國合格評定國家認可委員會認可的參考（校準）實驗室聯合定值。

1.4.3 定值及其引入的不確定度計算 根據測定數據服從正態分布狀態，組間數據是否為等精度進行計算[2]。

1.4.4 結果檢驗 采用Shapiro-Wilk進行正態分布檢驗，采用格拉布斯（Grubbs）法進行組內可疑值檢驗和各組數據平均值顯著性檢驗，組間數據等精度檢驗采用科克倫（Cochran）法。

1.4.5 標準值的不確定度評定 標準物質的合成標準不確定度（uCRM）計算公式為：

式中ubb為由甁間不均勻性引入的標準不確定度，ults為由長期（1年）不穩定性引入的標準不確定度，usts為由短期不穩定性引入的標準不確定度，uchar為由定值引入的標準不確定度。擴展不確定度（UCRM）按照公式：UCRM=合成標準不確定度（uCRM）×κ計算，式中κ為包含因子，此處κ=2（置信水平為95%）。

2 結果

2.1 均勻性單因素方差分析

根據自由度（14，30）及設定的顯著性水平（α=0.05），通過F值分布臨界值表查到臨界Fα=2.04，標準物質的F值分別為1.232（水平1）、1.656（水平2），F＜Fα，顯示標準物質具有良好的均勻性。見表1。

表1 α-淀粉酶標準物質均勻性單因素方差分析結果

2.2 穩定性評價結果

均值與時間關系的直線回歸方程為直線斜率|β1|＜t0.95，n-2·s（b1），式中n-2為自由度，P=0.95，s（b1）為直線斜率的標準偏差，斜率不顯著，未觀測到不穩定性，表明在規定的時間內均穩定。見表2。

表2 穩定性評價結果

2.3 互換性評價結果

各系統回歸方程的r2＞0.009 5，測量結果位于95%可信區間上、下限內。見表3。

表3 標準物質互換性評價結果

2.4 定值結果和不確定度

采用格拉布斯（Grubbs）法進行組內可疑值檢驗和各組數據平均值顯著性檢驗，結果顯示組內無可疑值。各實驗室平均值之間無顯著性差異，等精度檢驗的臨界值為0.422 9。其他結果見表4。

表4 α-淀粉酶標準物質定值結果和擴展不確定度

3 討論

利用冰凍混合人血清研制酶學二級標準物質，甚至一級標準物質，原料無基質效應，均勻性良好，穩定性可靠，但不易購買到。為解決我國同類產品供應不足的問題，本實驗室聯合其他5家參考實驗室，采用聯合定值的方法，研制了2個水平的α-淀粉酶冰凍混合人血清候選二級標準物質。聯合定值實驗室均通過了中國合格評定國家認可委員會依據ISO/IEC 17025和ISO 15195標準的認可，定值使用的方法為國際檢驗醫學溯源性聯合委員會推薦的一級參考方法[4]，所得結果直接溯源到國際單位，解決了我國商品化試劑盒校準品長期缺乏溯源性的問題。通過聯合定值，避免了單個實驗室產生的偏移，定值結果更可靠。

穩定性評估采用同步穩定性評估，將所有樣本保存在液氮條件下，在同一時間使用同一檢測系統進行檢測，避免了檢測系統不同時間、不同批號試劑或校準品，甚至儀器不同狀態引起的偏移。在測量過程中，測量樣本較多，且放置于開口樣本杯中，應縮短測量批之間的時間，否則測量結果變異較大。本研究研制的2個水平α-淀粉酶冰凍混合人血清候選二級標準物質的均勻性良好，可至少穩定1年，但與美國國家標準和技術研究所研制的標準物質909c相比，穩定期仍然較短。本實驗室將繼續監測，以分析標準物質穩定性的更長期限。

本研究采用科克倫（Cochran）法檢驗各實驗室間數據的等精度。選取的顯著性水平α不同，其判斷標準也不同。若最大方差與所有實驗室方差和之比＜α=0.05的科克倫（Cochran）檢驗臨界值C，表明各實驗室數據平均值為等精度；若＞α=0.05、＜α=0.01的科克倫（Cochran）檢驗臨界值C，表明該標準物質被檢驗的最大方差組為歧離值，與各實驗室核實并確認測量方法、測量條件及操作過程均無誤后，仍按等精度處理；若＞α=0.01的科克倫（Cochran）檢驗臨界值C在經確認測量方法、測量條件及操作過程均無誤后，應慎重采用不等精度加權方式處理。

本實驗室研制的冰凍混合人血清α-淀粉酶候選二級標準物質均勻性好，穩定性符合預期，具有可溯源性和互換性，對推動酶學檢驗的標準化進程意義重大。

（致謝：感謝上海市臨床檢驗中心居漪，四川邁克生物科技股份有限公司孫可其，美康生物科技股份有限公司沈敏，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司王英國，北京利德曼生化股份有限公司劉春龍在標準物質研制過程中給與的幫助。）