耐熱黑曲霉3.316產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶培養(yǎng)條件優(yōu)化及酶學性質(zhì)研究

張海娟，朱鳳妹，李軍

（河北科技師范學院食品科技學院，河北 秦皇島 066600）

黑曲霉（Aspergillus niger）分泌的葡聚糖酶在發(fā)酵上有一定的應用，最適pH值在4.0～6.0，最適溫度一般在50℃～60℃[1]。在啤酒釀造中，葡聚糖酶主要在糖化工業(yè)中應用，麥汁糖化溫度可以達到65℃～70℃[2]。在葡聚糖酶中，細菌來源的葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性普遍低于真菌，而且最適pH值普遍呈中性[3]。纖維素酶由3種葡聚糖苷酶組成：內(nèi)切葡聚糖苷酶（endo-1，4-β-D-glucanohydrolase，EG；EC 3.2.1.4），其負責纖維素纖維的無定形結構的內(nèi)部區(qū)域的隨機切割；纖維二糖水解酶（exo-1，4-β-D-glucanase，CBH；EC 3.2.1.91），主要作用于纖維素的結晶部分，催化纖維素纖維末端的葡萄糖或纖維二糖的釋放；β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，BG；EC 3.2.1.21），其不直接作用于纖維素，不被認為是真正的纖維素酶[4-6]。EG是能夠隨機催化水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子分解成小段的纖維葡聚糖和纖維末端以及底物專一的一種胞外酶，EG中的谷氨酸為催化位點，同時預測天冬氨酸也為催化位點，加快催化反應[7]。

纖維素酶分解纖維素的過程中不可缺少內(nèi)切葡聚糖苷酶的作用，近年來，內(nèi)切葡聚糖苷酶已經(jīng)在國內(nèi)外開展大量的研究，但是耐熱黑曲霉3.316菌種產(chǎn)生的胞外酶內(nèi)切葡聚糖苷酶卻并未研究[8]，3.316菌屬于中高耐熱菌，它的耐熱性雖不如嗜熱菌株，但是它在中高耐熱菌中較穩(wěn)定[9]。而且較以前研究的其它真菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶更全面，進行了鹽濃度、表面活性劑等研究，發(fā)現(xiàn)表面活性劑能提高酶活性。對耐熱黑曲霉產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶培養(yǎng)基優(yōu)化和酶學性質(zhì)的研究，不僅為纖維素酶的食品應用提供依據(jù)，同時為構建高效表達的基因工程菌提供了參考，還為蛋白質(zhì)工程奠定了基礎，目的是用于研究不同的食品工業(yè)化生產(chǎn)，此類研究正在進行中[10]。本試驗通過單因素和響應面分析進行黑曲霉3.316產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化及酶學性質(zhì)測定，旨在提高內(nèi)切葡聚糖苷酶活力，為進一步研究開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Aspergillus niger 3.316：中國微生物菌種保藏中心；小麥秸稈：江蘇省連云港市東海縣；硫酸銨：天津市風船化學試劑科技有限公司；微晶纖維素：天津市光復精細化工研究所；麥芽糖：天津市科密歐化學試劑有限公司。

種子培養(yǎng)基：FeSO4·4H2O 0.005 g，KCl 0.25 g，MgSO4·7H2O0.25g，K2HPO40.5g，NaNO31.5g，蔗糖15g，pH 6.5，蒸餾水 500 mL，121 ℃滅菌 20 min[11]。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基 ：CaCl20.15 g，MgSO40.15 g，K2HPO41.0g，（NH4）2SO42.0g，麩皮15 g，蒸餾水500 mL，pH 5.5，121 ℃滅菌 20 min[12]。

1.2 儀器

FJS-4磁力攪拌水浴鍋：金壇市城西富威實驗儀器廠；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TDL-4臺式離心機：臺北市萬方潤華實驗儀器廠；V-5100可見分光光度計：武漢高精密科學儀器有限公司；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：蘇州培英實驗設備有限公司。

1.3 酶活力的測定

酶活力：以1.0 mL粗酶液1 min水解底物產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位。計算公式[13]如下。

式中：IU為酶活力，U/mL；M為還原糖含量，mg；t為反應時間，min；D為稀釋倍數(shù)；Ew為粗酶液體積，mL；0.18 為 1 μmol葡萄糖的質(zhì)量，mg。

酶活的測定方法參照李永博等[14]的方法進行測定。

1.4 單因素試驗

1.4.1 碳源優(yōu)化

分別以麩皮+玉米粉、玉米纖維、麩皮+玉米纖維、麩皮+葡萄糖、玉米芯、麩皮、葡萄糖、小麥秸稈、麩皮+小麥秸稈、玉米秸稈粉、麩皮+玉米秸稈粉為碳源，研究不同的碳源對發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。

1.4.2 碳源濃度的篩選

分別以 10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/500 mL 為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源濃度，研究不同碳源濃度對發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。

1.4.3 氮源的篩選

以酵母浸粉、硫酸銨、蛋白胨、氯化銨、尿素、硫酸銨+尿素（質(zhì)量比1∶1）、硫酸銨+酵母浸粉（質(zhì)量比1∶1）、硫酸銨+蛋白胨（質(zhì)量比1∶1）為氮源，以未添加氮源為對照，研究不同的氮源對發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。

1.4.4 氮源優(yōu)化

分別以 1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 g/500 mL 為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源濃度，研究不同氮源濃度對發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。

1.4.5 誘導物的篩選

分別以微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、水楊苷、乳糖、麥芽糖、空白、羧甲基纖維素鈉+麥芽糖（1∶1）、微晶纖維素+羧甲基纖維素鈉（質(zhì)量比1∶1）、羧甲基纖維素鈉+乳糖（質(zhì)量比1∶1）、微晶纖維素+麥芽糖（質(zhì)量比 1∶1）、微晶纖維素+乳糖（質(zhì)量比 1∶1），微晶纖維素+水楊苷（質(zhì)量比1∶1）為誘導物，研究不同的誘導物對發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。

1.4.6 誘導物濃度的篩選

分別以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/500 mL 為發(fā)酵培養(yǎng)基的誘導物濃度，研究不同誘導物濃度對發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的組分優(yōu)化試驗設計

選取小麥秸稈（A）、硫酸銨（B）、微晶纖維素+麥芽糖（C）為響應面的3個單因素變量，建立以內(nèi)切葡聚糖苷酶（Y）為響應值的多元性回歸模型方程。利用Design-Expert 8.0進行響應面試驗設計和分析[15]。

1.6 4種酶理化性質(zhì)的測定

1.6.1 溫度對酶活力的影響及最適溫度的測定

將 1 mL 粗酶液在 30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中反應30 min后測定酶活。將粗酶液在50℃條件下保溫1 h時間后，測定其剩余酶活力，確定溫度對酶熱穩(wěn)定性的影響[16]。

1.6.2 pH值對酶活力的影響及最適pH值的測定

將1 mL粗酶液在50℃下反應30 min后，pH1～8時，測定其酶活。將粗酶液在50℃條件下保溫1 h時間后，測定其剩余酶活力，確定pH值對酶穩(wěn)定性的影響[16]。

1.6.3 不同金屬離子對酶活力的影響

將1mL 粗酶液，分別加入 0.5mLKCL、NaCl、MnSO4、MgSO4、FeSO4、CuSO4金屬離子溶液以及 0.5 mL 去離子水，保溫1 h后測定其粗酶活。

1.6.4 不同濃度的鹽溶液對酶活力的影響

將1 mL粗酶液和0.5 mL 0～10g/L濃度的NaCl溶液，在水浴鍋中反應30 min后，測定其粗酶活。

1.6.5 不同濃度的表面活性劑對酶活力的影響

將1 mL粗酶液和0.5 mL 0～0.5g/L濃度的吐溫-80，反應30 min后，測定其粗酶活[17]。

1.6.6 動力學常數(shù)-米氏常數(shù)Km值的測定

取6支比色管，分別加入濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L的羧甲基纖維素鈉作為底物，在最適溫度、最適pH值的環(huán)境下反應，測定其酶活力[18]。米氏方程如下。

式中：V為反應速率，mmol/min；Vmax為最大反應速率，mmol/min；S為底物濃度，mol/L。根據(jù)米氏方程做Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Microsoft Excel 2010表格繪圖、SPSS 21軟件、Duncan氏多重比較、Canoco for Windows 4.5、Design-Expert 8.0進行響應面試驗設計和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源的確定

不同碳源對酶活力的影響見圖1。

圖1 不同碳源種類對酶活力的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on enzyme activity

選取單一物質(zhì)和混合物質(zhì)為碳源，圖1結果表明小麥秸稈是黑曲霉產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶的最適碳源，同時小麥秸稈也是最普遍、低廉的物質(zhì)，滿足了工業(yè)上對廉價碳源的要求。

2.1.2 小麥秸稈濃度的確定

不同濃度小麥秸稈對酶活力的影響見圖2。

圖2結果表明，內(nèi)切葡聚糖苷酶在濃度10g/500mL～15 g/500 mL時，酶活力上升，但是在15 g/500 mL～20 g/500 mL時，酶活力下降。小麥秸稈中含有豐富的糖物質(zhì)，當糖達到一定量時，能夠促進微生物生長產(chǎn)酶，但是當糖含量太高，反而抑制微生物的生長，從而影響產(chǎn)酶量。另外小麥秸稈的添加量過多，會影響微生物的通氧量，致使微生物不能呼吸而影響產(chǎn)酶結果。綜上所述，選擇15 g/500 mL為最適濃度并以此為響應面試驗中心點。

圖2 不同濃度小麥秸稈對酶活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of wheat straw on enzyme activity

2.1.3 氮源的確定

不同氮源對酶活力的影響見圖3。

圖3 不同氮源種類對酶活力的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on enzyme activity

選用有機氮源和無機氮源，圖3結果表明硫酸銨是黑曲霉產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶最適的氮源。

2.1.4 硫酸銨濃度的確定

不同濃度硫酸銨對酶活力的影響見圖4。

圖4 不同濃度氮源對酶活力的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources at different concentrations on enzyme activity

圖4結果表明，內(nèi)切葡聚糖苷酶在1.5 g/500 mL～2.25 g/500 mL范圍內(nèi)逐漸增加，至2.25 g/500 mL濃度酶活力達到最大，2.25 g/500 mL～2.50 g/500 mL酶活力降低；氮源微生物生長必不可少的物質(zhì)之一，若氮源含量過多，不利于蛋白質(zhì)和氨基酸的合成，對菌體細胞物質(zhì)有傷害。綜上所述，2.25 g/500 mL為最適濃度并以此為響應面試驗中心點。

2.1.5 誘導物的確定

不同誘導物對酶活力的影響見圖5。

圖5 不同誘導物種類對酶活力的影響Fig.5 Effects of different induced species on enzyme activity

選用單一誘導物和混合誘導物，圖5結果表明，微晶纖維素+麥芽糖是內(nèi)切葡聚糖苷酶最適合的誘導物。

2.1.6 微晶纖維素+麥芽糖濃度的確定

不同濃度微晶纖維素+麥芽糖對酶活力的影響見圖6。

圖6 不同濃度誘導物對酶活力的影響Fig.6 Effects of different concentrations of inducers on enzyme activity

圖6結果表明，內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活力在0.5 g/500 mL～1.0 g/500 mL逐漸下降，在1.0 g/500 mL～2.0 g/500 mL上升，在2.0 g/500 mL～2.5 g/500 mL下降；誘導物能夠影響結合蛋白，從而影響轉錄基因的表達，激發(fā)特定酶的合成，誘導物濃度高的話，會降低結合蛋白的形成，也就無法啟動轉錄基因的表達。綜上所述，2.0 g/500 mL為最適濃度并以此為響應面試驗中心點。

2.2 中心組合試驗結果及響應面分析

Box-Behnken試驗設計：根據(jù)單因素試驗結果，進行Box-Behnken試驗設計[19]，試驗因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素及其水平Table 1 Levels of variables tested in Box-Benhnken design

表2 中心組合設計及結果Table 2 Experimental matrix and results with central composite design

2.3 二次回歸方程擬合及方差分析

以Y（內(nèi)切葡聚糖苷酶的酶活力）為響應值的情況下，用中心組合設計（central composite design，CCD）程序進行多元回歸分析，獲得Y對A（小麥秸稈）、B（硫酸銨）、C（微晶纖維素+麥芽糖）的三元二次回歸方程：Y=4.36-0.061A-0.019B+0.13C+0.042AB-0.013AC-0.097BC-0.32A2-0.25B2-0.20C2?；貧w模型和方差分析見表3。

由表3可知，Y回歸方程的失擬檢驗P>0.05，差異不顯著?？偦貧w方程P<0.000 1，為極顯著水平。證明了模型試驗與實際試驗擬合度很好，可以用于發(fā)酵試驗的預測。在考察各個因素的相互作用時，可以看到差異極顯著。由表3回歸模型和方差可知，對內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活力的顯著性影響為C、A顯著性大于B顯著性。小麥秸稈和微晶纖維素+麥芽糖各自作為碳源和誘導物，對產(chǎn)酶的影響極顯著，硫酸銨作為氮因素，是簡單的氮源，能促進細胞的生長和產(chǎn)酶量，影響也是顯著的。不同因素間的影響不同，對產(chǎn)酶量的影響也不同。

表3 中心組合設計回歸模型及方差Table 3 CCD regression models and ANOVA

2.4 響應因子的水平優(yōu)化

各因素間交互作用的響應面圖見圖7。

由繪出的響應面圖得出，通過三者的交互作用確定出最優(yōu)點，每個圖代表兩個因素間的相互作用，此時第3個變量在中心水平位置[20]，內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活存在極值點，說明試驗因素選取合理。由圖7響應面立體圖結果顯示，當小麥秸稈含量固定不變時，酶活力隨微晶纖維素+麥芽糖的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢。小麥秸稈與硫酸銨的相互作用（圖7a）影響極顯著；小麥秸稈和微晶纖維素+麥芽糖的相互作用（圖7b）影響不顯著；硫酸銨和微晶纖維素+麥芽糖相互作用（圖7c）影響極顯著。

圖7 各因素交互作用的響應面圖Fig.7 Response surface map of the interaction of various factors

以小麥秸稈16.29 g/500 mL、硫酸銨2.24 g/500 mL、微晶纖維素+麥芽糖2.16 g/500 mL、CaCl20.15 g/500 mL、MgSO40.15 g/500 mL、K2HPO41.0 g/500 mL為發(fā)酵培養(yǎng)基，分5組進行發(fā)酵驗證。內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活力為4.257 U/mL，與模型的誤差值<3%。表明該模型能夠很好地預測內(nèi)切葡聚糖苷酶的發(fā)酵情況。

2.5 酶學性質(zhì)

2.5.1 內(nèi)切葡聚糖苷酶最適溫度的測定

當作用時間、pH值不變時，在不同溫度下，在恒溫水浴鍋中反應30 min后，得出結果如圖8所示。

圖8 內(nèi)切葡聚糖苷酶最適溫度Fig.8 The optimum tempera of endoglucanase

內(nèi)切葡聚糖苷酶在30℃～60℃上升趨勢相對緩慢，在60℃達到峰值，但在60℃～70℃下降趨勢顯著。由此說明，溫度對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力影響較大，最適溫度為60℃。

2.5.2 內(nèi)切葡聚糖苷酶的熱穩(wěn)定性

粗酶溶液在 30、40、50、60℃和 70℃的水浴中溫浴60 min，并測定殘留的酶活性，以保溫前酶活力為100%[21]，得出曲線如圖9所示。

圖9 內(nèi)切葡聚糖苷酶熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stability of endoglucanase

內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活力在30℃～50℃上升趨勢相對緩慢，在50℃～70℃下降趨勢顯著，50℃時相對酶活力達到102%。由此說明，50℃時內(nèi)切葡聚糖苷酶熱穩(wěn)定性最好。研究結果說明內(nèi)切葡聚糖苷酶適合在較高溫環(huán)境中發(fā)揮作用，并且熱穩(wěn)定性較強。

2.5.3 內(nèi)切葡聚糖苷酶最適pH值的測定

通過試驗分別測定了pH值為1～8時的酶活力，結果圖10所示。

圖10 內(nèi)切葡聚糖苷酶最適pH值Fig.10 Optimum pH of endoglucanase

內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活力在pH值為1～3時，曲線呈上升趨勢，pH3時相對酶活最大，pH值在3～8時，曲線持續(xù)呈下降趨勢。由此可以得出pH值對于酶活力影響較大，隨著pH值的逐漸升高，酶活力降低。

2.5.4 內(nèi)切葡聚糖苷酶在不同pH值下的穩(wěn)定性

內(nèi)切葡聚糖苷酶在不同pH值下的穩(wěn)定性見圖11。

在如圖11所示，pH值為1～5時，內(nèi)切葡聚糖苷酶相對酶活力曲線持續(xù)呈上升趨勢，在pH 5時，它的相對酶活力最大，達到原酶活的80%左右，在pH值為5～8時，曲線持續(xù)呈下降趨勢，在pH值等于8時，達到原酶活的60%左右，即最低點。數(shù)據(jù)證明，在pH 5時，內(nèi)切葡聚糖苷酶的穩(wěn)定性最好。

圖11 內(nèi)切葡聚糖苷酶在不同pH值下的穩(wěn)定性Fig.11 Stability of endoglucanase at different pH

2.5.5 不同金屬離子對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力的影響

不同金屬離子對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力影響見圖12。

圖12 不同金屬離子對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力影響Fig.12 Effect of different metal ions on the activity of endoglucanase

本試驗選取幾種常見金屬離子[22]，對照組和試驗組在相同環(huán)境下試驗，以對照組為最高酶活（100%），其余為相對酶活。酶蛋白的穩(wěn)定性會在這種情況下被不同的金屬離子所影響。通過與空白對照的對比，Na+、Mn2+對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力呈抑制作用，且Mn2+呈強抑制作用而 Na+則影響微弱。Mg2+、Fe2+、Cu2+、K+對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力呈促進作用，其中Cu2+、K+呈強促進作用而Mg2+、Fe2+則促進作用微弱。但總的來說，金屬離子對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力的影響相對較小。

2.5.6 不同濃度的NaCl鹽溶液對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力的影響

使用濃度分別為 0、2、4、6、8、10 g/L 的 NaCl溶液，在同樣的環(huán)境下反應，以NaCl濃度為0的酶活力為100%，得出不同濃度的鹽溶液對酶活影響，結果見圖13。

圖13 不同鹽濃度對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力的影響Fig.13 Effect of different salt concentration on endoglucanase activities

由圖13可知，在鹽濃度為2 g/L的時候，相對酶活達到最大值92.96%，在6 g/L時，達到最低點，因其相對酶活都分布在90%左右，波動幅度較小，由此鹽濃度對內(nèi)切葡聚糖苷酶有較小的抑制作用。

2.5.7 不同濃度的表面活性劑對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力的影響

使用濃度分別為 0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的吐溫-80，在同樣環(huán)境、不同質(zhì)量濃度的表面活性劑條件下，以吐溫-80濃度為0%的試驗組的酶活力為100%，測定其它濃度下的相對酶活[23]，結果見圖14。

圖14 表面活性力對內(nèi)切葡聚糖苷酶活力的影響Fig.14 Effect of surface activity on activity of endoglucanase

由圖14可知，當表面活性劑濃度為0.1%～0.2%時，相對酶活性上升，當表面活性劑濃度為0.2%～0.3%，相對酶活性降低；當表面活性劑濃度為0.3%～0.5%之間時，相對酶活性逐漸上升，但是相對酶活力都大于未添加表面活性劑的相對酶活力。說明表面活性劑促進了內(nèi)切葡聚糖苷酶的活性。

2.5.8 內(nèi)切葡聚糖苷酶動力學常數(shù)的測定

通過試驗，使粗酶液在不同濃度的羧甲基纖維素鈉溶液中，反應一定時間，測酶活力，得出不同濃度的底物對酶活影響[24]，結果見圖15。

圖15 不同濃度羧甲基纖維素鈉為底物的內(nèi)切葡聚糖苷酶動力學常數(shù)的測定Fig.15 Determination of kinetic constants of endoglucosidase with sodium carboxymethyl cellulose of different concentrations as substrates

由圖15可知，根據(jù)米氏方程，即可得到1/V=5.86×1/S+277.46，Km=0.0211 mol/L，Vmax=0.003 6 mmol/min，當羧甲基纖維素鈉濃度越大時，酶活力越大，反應速度越大。

3 結論

本研究通過單因素和響應面法對黑曲霉3.316產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基條件進行優(yōu)化，優(yōu)化的培養(yǎng)基使得該菌株產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活力強，性能優(yōu)良。耐熱黑曲霉3.316產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶結果表明：優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為小麥秸稈16.29 g/500 mL，硫酸銨2.24g/500mL，微晶纖維素+麥芽糖2.16g/500mL，CaCl20.15 g/500 mL，MgSO40.15 g/500 mL，K2HPO41.0 g/500 mL。對酶學性質(zhì)進行測定：內(nèi)切葡聚糖苷酶適合在高溫酸性環(huán)境中生存，同時Cu2+、K+有較大促進作用，表面活性劑對內(nèi)切葡聚糖苷酶也有促進作用，同時羧甲基纖維素鈉是內(nèi)切葡聚糖苷酶的最適底物，得到這些性質(zhì)后可以將內(nèi)切葡聚糖苷酶更廣泛的應用在食品中。同時也可在調(diào)控蛋白基因方面進行深度研究[25]。