索骨丹中黃酮的抗氧化活性分析*

張 韞，楊 秀，劉 學，史瑞萌，馬曉彤

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

索骨丹，又名水五龍、慕荷、牛角七等，是虎耳草科植物七葉鬼燈檠的根莖，有涼血止血，消腫解毒等作用，內用可治療甲狀腺腫、咽喉腫痛，外用可治療外傷出血、子宮脫垂等[1]。索骨丹中含有多元酚、蒽醌、黃酮、多糖等多種成分，黃酮是其主要成分之一[2]。索骨丹中的黃酮具有良好的抗氧化性，對自由基能起到清除作用，同時可防止細胞衰老退化并增強免疫力[3]。

實驗主要用超聲提取法提取索骨丹中的黃酮，然后以黃酮為抗氧化劑(自由基清除劑)，用熒光和紫外光譜法測定索骨丹黃酮對羥自由基、亞硝酸鹽、超氧陰離子的清除及對鐵離子還原能力，并與經典抗氧化性劑(維生素C)對比，分析評價索骨丹中黃酮的抗氧化性。實驗從清除自由基能力的角度評價索骨丹黃酮的體外抗氧化活性，為索骨丹藥材的深入開發利用及大規模工業化生產提供理論依據，對新型食品添加劑的研發也具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

索骨丹藥材：經西安醫學院汪興軍老師鑒定為七葉鬼燈檠的根莖；蘆丁：純度98%，批號20140919，士鋒生物科技有限公司；焦性沒食子酸、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽：分析純，科密歐化學試劑有限公司；苯甲酸：分析純，北聯精細化學品開發有限公司；無水對氨基苯磺酸：分析純，天力化學試劑有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：純度99.7%，阿拉丁化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純，市售。

紫外-可見分光光度計：UV-762，酸度計：PHS-3C，上海佑科儀器儀表有限公司；熒光分光光度計：LS-55，美國PerkinElmer有限公司；旋轉蒸發器：RE-2000A，循環水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，予華儀器有限責任公司；高速萬能粉碎機：FW200A，北京科偉永興儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：黃驊航天儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集與處理

索骨丹藥材粉碎過250 μm篩，得索骨丹粉末。稱取30 g索骨丹粉末置于索氏提取器中，加入3倍體積的石油醚回流去除脂質，至石油醚呈無色，揮干溶劑備用。稱取處理后的索骨丹粉末5 g置于錐形瓶中用乙醇作為提取溶劑，以超聲法提取總黃酮，并旋蒸濃縮溶劑至20～30 mL，得索骨丹黃酮提取液。采用真空干燥法烘干溶劑用分析天平準確稱量，確定黃酮的濃度。

1.2.2 紫外-可見分光光度法測定索骨丹黃酮的抗氧化能力

1.2.2.1 索骨丹黃酮對羥自由基的清除能力

Fenton反應產生的羥自由基與加入的水楊酸生成2，3-二羥基苯甲酸，該物質在510 nm處有紫外-可見區吸收[4-5]。如在反應體系中加入抗氧化物質降低體系中的羥自由基濃度，就會降低2，3-二羥基苯甲酸濃度，導致510 nm處的吸光度減小。

精密吸取1.0 mLc(FeSO4)=8.8 mmol/L溶液于試管中，依次加入1.0 mLc(水楊酸)=9.1 mmol/L溶液、1.0 mL索骨丹提取溶液、5.0 mL蒸餾水振蕩混勻后加入1.0 mL質量分數 0.06% H2O2溶液，避光條件下37 ℃水浴30 min，于510 nm處測定吸光度A1；將索骨丹提取溶液替換成等量蒸餾水，測得吸光度為A0。清除率的計算見公式(1)，同法測定相同質量濃度下維生素C的清除率。

(1)

1.2.2.2 索骨丹黃酮對亞硝酸鹽的清除能力

在2個10 mL的容量瓶中均加入5.0 μg/mL的NaNO22 mL，其中一個容量瓶中加入5 mL黃酮提取液，搖勻放置10 min，另一份作空白。兩瓶內均加入2 mL質量分數0.4%對氨基苯磺酸溶液，搖勻放置5 min，再加入1 mL質量分數0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加水定容，靜置15 min。在583 nm處測吸光度，加黃酮提取液的溶液測得吸光度A1，未加黃酮提取液的溶液吸光度A0，以公式(1)計算清除率[4-7]，同法測定相同濃度下維生素C的清除率。

1.2.2.3 索骨丹黃酮對超氧陰離子的清除能力

將1.0 mL不同濃度黃酮提取液加入2.5 mLc(Tris-HCl)=50 mmol/L緩沖液(pH=8.2)，定容于25 mL容量瓶。在25 ℃下反應20 min，再加入1.0 mLc(鄰苯三酚)=3.0 mmol/L溶液反應5 min，加入HCl溶液終止反應，在325 nm處測定吸光度記為A1，用等體積的蒸餾水代替黃酮提取液，測得吸光度為A0，代入公式(1)計算清除率，同法測定相同濃度下維生素C對超氧陰離子的清除率[8]。

1.2.2.4 鐵離子還原能力(FRAP)測定

FRAP工作液的配制：0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液，以體積比10∶1∶1比例混合配制FRAP工作液，現配現用。

FeSO4標準曲線的繪制：吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL FeSO4溶液各0.1 mL，加入3.0 mL FRAP工作液，3.0 mL蒸餾水，37 ℃反應5 min。以蒸餾水代替FeSO4加入FRAP工作液為空白，于593 nm處測定吸光度。以質量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標，以吸光度值A為縱坐標，繪制FeSO4標準曲線。標準曲線回歸方程為A=1.47ρ+0.07，相關系數R=0.999 1。

樣品的抗氧化活性(FRAP值)以達到相同吸光度所需FeSO4的物質的量表示(mmol)。取不同質量濃度的黃酮樣品溶液0.030、0.060、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL 0.1 mL，用上述FeSO4的方法測定抗氧化能力。根據FeSO4標準曲線計算出對應FeSO4溶液的濃度，樣品的抗氧化活性以達到同樣的吸光度數值為FRAP值[9-10]。同法測定相同質量濃度下維生素C的抗氧化活性。

1.2.3 熒光分光光度法測定索骨丹黃酮的抗氧化能力

1.2.3.1 索骨丹黃酮對羥自由基的清除能力

在10 mL的比色管中，依次加入pH=5.47 KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液2.0 mL，c(苯甲酸)=1.0 mol/L溶液2.0 mL，c(FeSO4)=1.0 mmol/L溶液0.6 mL，質量分數0.3% H2O2溶液1.2 mL，加蒸餾水定容至刻度，混勻，反應2 h，進行熒光光譜掃描確定最大激發波長及發射波長[5]。

按上述方法加入試劑，以λex=290 nm、λem=598 nm為測定波長，狹縫均為10 nm，掃速為300 nm/min，測定上述體系的熒光強度F，計算其與空白參比溶液(苯甲酸與緩沖溶液)熒光強度F0之差ΔF，由此可間接求得Fenton體系所產生羥自由基的量[11-12]。于上述的Fenton體系中，加入不同濃度的索骨丹黃酮提取液再加入FeSO4溶液，同法測定熒光強度Fs，則羥自由基清除率的計算見公式(2)。

(2)

1.2.3.2 索骨丹黃酮對超氧陰離子的清除能力

在第1個試管中加入索骨丹的黃酮提取液和0.8 mLc[Al(NO3)3]=1.0 mmol/L溶液搖勻，稀釋至5 mL，5 min后以λex=320 mm、λem=596 nm為測定波長，狹縫10 nm，掃速300 nm/min，測其熒光強度F0。在另一試管中加入pH=8.2 Tris-HCl 緩沖液2.0 mL，在25 ℃中加熱10 min，再加入預熱過的c(鄰苯三酚)=0.3 mmol/L溶液0.1 mL，立即加入不同濃度的黃酮提取液，反應4 min后加入c[Al(NO3)3]=1.0 mmol/L溶液搖勻，稀釋至5 mL，測其熒光強度F1。計算清除率見公式(3)。

(3)

2 結果與討論

2.1 紫外分光光度法的測定結果

2.1.1 對羥自由基清除的測定

紫外光譜法測定黃酮對羥自由基清除率，見圖1。

ρ/(μg·mL-1)圖1 紫外光譜法測定黃酮對羥自由基清除率

由圖1可知，索骨丹黃酮對羥自由基的清除率隨質量濃度的不斷增大而增大，ρ(索骨丹黃酮)=16 μg/mL，清除率可達63.54%；ρ(維生素C)=16 μg/mL時清除率為55.52%。質量濃度范圍相同，索骨丹黃酮對羥自由基的清除能力優于維生素C的清除能力。

2.1.2 對亞硝酸鹽清除的測定

ρ/(μg·mL-1)圖2 紫外光譜法測定黃酮對亞硝酸鹽的清除率

由圖2可知，ρ(索骨丹黃酮)=1～6 μg/mL，對亞硝酸鹽的清除率是隨質量濃度的增大而增大，最高可達66.38%，ρ(索骨丹黃酮)=6～14 μg/mL，對亞硝酸鹽的清除率呈平穩趨勢，基本保持在約66%；ρ(維生素C)=1～4 μg/mL，對亞硝酸鹽的清除率隨質量濃度的增大而迅速增大，ρ(維生素C)=4～14 μg/mL，清除率上升趨勢減緩，其清除率最高可達52.55%，可以看出，質量濃度范圍相同，索骨丹黃酮對亞硝酸鹽的清除能力優于維生素C。

2.1.3 對超氧陰離子清除的測定

鄰苯三酚發生自氧化反應生成超氧陰離子，在325 nm處有最大紫外吸收。如在體系中加入能清除超氧陰離子的物質可以使生成的超氧陰離子含量降低，從而導致吸光度降低。因此，可通過測定325 nm處吸光度的判斷索骨丹中黃酮對超氧陰離子的清除能力，見圖3。

ρ/(μg·mL-1)圖3 紫外光譜法測定黃酮對超氧陰離子的清除率

由圖3可知，ρ(索骨丹黃酮)=1～16 μg/mL，對超氧陰離子的清除率隨質量濃度的增大而增大，拐點位于2.5 μg/mL，清除率最高可達87.66%；ρ(維生素C)=1～10 μg/mL，對超氧陰離子的清除率是隨質量濃度的增大而增大，ρ(維生素C)=10～16 μg/mL，清除率隨質量濃度的增大基本不變甚至有下降趨勢，其最大清除率達71.22%。質量濃度范圍相同，索骨丹黃酮對超氧陰離子的清除能力優于維生素C。

2.1.4 對鐵離子還原能力的測定

Fe3+與TPTZ在酸性條件下無顏色反應，加入抗氧化物質時發生還原反應生成藍色Fe2+-TPTZ，在593 nm處有紫外吸收。測定593 nm吸光度就可以確定總抗氧化能力，見圖4。

ρ/(μg·mL-1)圖4 鐵離子還原能力測定

由圖4可知，ρ(索骨丹黃酮)=0.03～0.5 μg/mL，對鐵離子的還原隨質量濃度的增大而迅速增大的，ρ(索骨丹黃酮)=0.5～1.0 μg/mL清除率趨于平穩；ρ(索骨丹黃酮)=0.03～0.5 μg/mL，對鐵離子的還原隨質量濃度的增大而迅速增大，ρ(索骨丹黃酮)=0.5～1.0 μg/mL，清除率趨于平穩，FRAP最大值為0.372。在該質量濃度范圍索骨丹黃酮對鐵離子的還原能力依然優于維生素C的清除能力。

2.2 熒光光譜法的測定結果

2.2.1 對羥自由基清除的測定

實驗發現索骨丹黃酮對體系的熒光有猝滅作用。以ρ(索骨丹黃酮)為橫坐標，對羥自由基的清除率為縱坐標作圖，見圖5。

由圖5可知，ρ(索骨丹黃酮)=26～433 μg/mL，索骨丹黃酮對羥自由基的清除率是隨質量濃度的增大而增大，ρ(索骨丹黃酮)=433 μg/mL清除率最大，達95.54%。

ρ/(μg·mL-1)圖5 熒光光譜法測定黃酮對羥自由基的清除率

2.2.2 對超氧陰離子清除的測定

以ρ(索骨丹黃酮)為橫坐標，對超氧陰離子清除率為縱坐標作圖，見圖6。

ρ/(μg·mL-1)圖6 熒光測定黃酮對超氧陰離子的清除率

由圖6可知，ρ(索骨丹黃酮)=0～65 μg/mL，清除率隨質量濃度增大而增大，ρ(索骨丹黃酮)=65 μg/mL，索骨丹黃酮對超氧陰離子的清除率最大達77.67%，隨后隨著質量濃度的增大清除率逐漸減小。

3 結 論

實驗采用紫外-可見分光光度法和熒光分光光度法，以維生素C為對照，測定索骨丹黃酮對自由基的清除能力。結果表明索骨丹的黃酮對超氧陰離子、羥自由基、亞硝酸鹽3種自由基具有一定的清除能力且對鐵離子有較好的還原能力，且清除作用隨質量濃度增加而增強，均優于經典抗氧化劑維生素C，具有良好的抗氧化活性。對陜西地方藥材索骨丹的深度開發及抗氧化研究提供了理論基礎和實驗參考。