去卵巢手術對雌性高脂血癥大鼠主動脈脂質代謝的影響

黃 赫，管仲瑩，趙 磊

(遼寧中醫藥大學附屬第二醫院檢驗科，遼寧 沈陽 110034)

隨著經濟的快速發展，近年來人們的飲食發生了很大的變化，脂肪食品占日常飲食的很大一部分。 持續的高脂飲食會導致體內的脂質代謝紊亂，主要表現為高水平的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高膽固醇血癥和低水平的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)[1]。 糖脂代謝紊亂與糖代謝紊亂和脂代謝紊亂相聯系，可誘發肥胖、2型糖尿病(T2DM)、高血壓、血脂異常、非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化等。除此以外，脂蛋白水平將受到干擾或合并脂質代謝紊亂，同時HDL-C水平降低，總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和LDL-C水平升高。最后，過度脂肪堆積引起肥胖并導致高脂血癥。高脂血癥被歸類為導致心血管疾病發生的主要危險因素之一。越來越多的證據表明，高脂血癥是心血管疾病的主要原因，與冠心病、中風、高血壓、肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病等疾病密切相關[2]。脂質代謝紊亂是動脈粥樣硬化的病變基礎，而主動脈粥樣硬化常無特異性癥狀。本研究采用去卵巢手術模擬絕經期，探討絕經期對高脂血癥大鼠主動脈脂代謝的可能影響，進而闡明絕經期高脂血癥影響主動脈血管脂質代謝的精細分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料:30只健康雌性SD大鼠(200±20)g購買于遼寧長生生物技術股份有限公司，合格證號為SCXK(遼)2015-0001。RNA提取試劑RE-03012購自FOREGENE公司，ABclonal 2×快速熒光定量qRCR反應預混液(低Rox)RK21202購自ABclonal公司，反轉錄試劑盒RR047A購自寶生物工程(大連)有限公司，大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C ELISA 試劑盒(批號201912)購自上海酶聯生物科技有限公司。德國Thermo公司Multiskan FC酶標儀，ABI7500實時定量PCR儀。

1.2方 法

1.2.1動物模型的建立:30只健康SD雌性大鼠適應性喂養7d后，隨機分為空白組、模型1組、模型2組。模型2組大鼠去除雙側卵巢，術后腹腔注射青霉素3d以防感染，陰道分泌物圖片確定未出現后造模：模型1組和模型2組大鼠每天給予高脂飼料(3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%豬油)連續8周，造模第7天、14天分別給予維生素D3(50萬IU/kg、30萬IU/kg)灌胃，第7周給予異丙腎上腺素(ISO)5mg/kg多點皮下注射，連續1周[3]。

1.2.2標本采集:空白組、模型1組、模型2組每日1次灌服同等容積蒸餾水。各組給藥8周后分離心臟主動脈，液氮速凍后保存在-80℃冰箱。

1.2.3試劑盒提取大鼠主動脈血管mRNA:取心臟主動脈組織20mg 加入500μL Buffer RL1，電動勻漿器將組織研磨均勻；將研磨均勻的勻漿液轉移至 DNA-Cleaning Column中(DNA-Cleaning Column 放入收集管中)，12000 rpm離心 2min；移除 DNA-Cleaning Column， 保留收集管內上清液；向上述上清液中加入 1.6倍體積Buffer RL2(使用前請確認已按照說明加入無水乙醇)，輕柔混勻；將 700μL混合液轉移至 RNA-only Column 中(純化柱放入收集管中)，12000rpm離心 1min，棄掉收集管中的廢液；將純化柱放回收集管中，將剩余混合液全部加入純化柱中，12000rpm，離心1min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入500μL Buffer RW1，12000rpm離心1min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入700μL Buffer RW2(使用前請確認已按照說明加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄掉收集管中的廢液，重復1次；將純化柱放回收集管中，12000rpm空管離心2min，去掉離心柱中殘余的Buffer RW2；將純化柱轉移至新的離心管中，向純化柱的膜中央滴加50～200μL已于 65℃預熱的RNase-Free ddH2O，室溫放置2min。12,000rpm離心1min收集RNA溶液。為提高RNA產量，將離心得到的RNA溶液重新加至純化柱中，重復步驟1次。

1.2.4反轉錄反應:反應1：5×gDNase Mix 2.0μL，Template(RNA)5μL,RNase-Free ddH2O 3μL,42℃ 2min，4℃ +∞；反轉錄反應2：反應液1 10μL，5*RO-Easy Mix 4μL，RNase-Free ddH2O 6μL，37℃ 15min,85℃ 5s,4℃ +∞。

1.2.5實時定量PCR反應:采用SYBR Green法測定不同組目的基因的相對表達量。實時定量PCR引物見表1。PCR反應體系：cDNA 0.4μL，上游引物(10M) 0.4μL，下游引物(10M)0.4μL，2×SYBR Green Fast qPCR Mix with Low Rox 10μL，ddH2O 8.8μL。PCR反應程序：95℃ 2min；95℃ 15s，60℃ 1min，72℃ 1min，40cycles；95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 15s,60℃ 15s。使用β-actin為內參基因，目標基因相對表達量RQ=2-△△CT(△CT=CT目標-CT內參，△△CT=△CT模型組-△CT對照組)，目標基因相對表達量以平均數±標準差表示。

表1 引物序列

1.2.6ELISA測定大鼠血清總膽固醇含量:標準品的加樣：設置標準孔和樣本孔，標準品孔加不同濃度的標準品50μL；加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步驟相同)、待測樣品孔；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋劑40μL，然后再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)；加樣將樣品加于酶標孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；加酶：每孔加入酶標試劑100μL，空白孔除外；溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60min；配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，沒空加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復5次，拍干；顯色：每孔加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min；終止：每孔加入終止液50L，終止反應；測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度。測定應在加終止液后15min以內進行。

1.3統計方法:采用SPSS15.0分析實驗數據，結果以均數±標準差表示，統計學處理用單因素方差分析，以P<0.05有統計學意義。

2 結 果

2.1大鼠血清血脂含量測定:①與空白組相比，模型1組和模型2組TC、TG、LDL-C含量明顯增加升高(P<0.01)，HDL-C含量明顯降低(P<0.01)，差異有統計學意義。②同模型1組比較，模型2組TC、TG、LDL-C含量顯著升高(P<0.01)，HDL-C含量明顯降低(P<0.01)，具有統計學意義。詳見表2。

表2 去卵巢手術對大鼠血清血脂的影響

2.2大鼠主動脈ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA水平比較:①與空白組相比，模型1組和模型2組ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA相對表達量明顯降低(P<0.01)，差異有統計學意義。②模型2組ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR 相對表達量顯著低于模型1組(P<0.01)。詳見表3。

表3 大鼠主動脈ABCA1 ApoA1 CAV1 SRB1 VLDLR LDLR mRNA表達水平測定

3 討 論

高脂血癥常伴有脂質代謝異常，如低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平升高，以及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低。高脂血癥是心血管疾病的主要危險因素，而心血管疾病是全球死亡率的主要原因之一[4]。

動脈粥樣硬化是一種與脂質和其他代謝改變相關的動脈炎癥性疾病[5]。它也是心臟病和中風等心血管疾病的一個重要因素，世界各地的發病率和死亡率均增加[6]。動脈粥樣硬化主要由脂質積累和免疫細胞過濾，以及分子相互作用引起，導致斑塊的發生、破裂和血栓形成[7]。動脈粥樣硬化分為很多種，其中主動脈粥樣硬化大多數無明顯臨床癥狀。許多研究高脂血癥大鼠疾病發生的分子機制集中在肝臟，而本研究從主動脈角度探索絕經期對高脂血癥女性的影響的可能機制。

小窩蛋白的作用是介導脂蛋白分子的內吞和外吞以及脂質跨膜轉運,小窩蛋白受體LDLR、SR-B1和ABCA1主要介導脂質的外流。研究表明小窩蛋白-1(Caveolin-1，Cav-1)與脂質代謝相關,低密度脂蛋白受體(LDLR)、極低密度脂蛋白受體(VLDLR)、ATP結合盒轉運蛋白a1(ABCA1)以及B類清道夫受體(SRB1) 共同組成脂質跨膜轉運系統[8]。 ApoA1為高密度脂蛋白的重要結構蛋白，高密度脂蛋白(HDL)、LDL、極低密度脂蛋白(VLDL)以及蛋白質膽固醇輸送蛋白(CETP)共同組成細胞外脂質沉積系統。ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA水平的改變與脂質代謝密切相關。

LDL、TC和TG與高脂血癥發生密切相關。高脂血癥是脂質異常轉運的直接結果，通過脂質轉運蛋白及其受體在脂質轉運中發揮關鍵作用。與空白組相比，模型1組和模型2組TC、TG、LDL-C含量明顯增加(P<0.01)，HDL-C含量明顯降低(P<0.01)，提示造模成功，模型2組TC、TG、LDL-C含量明顯高于模型1組(P<0.01)，HDL-C含量明顯低于模型1組(P<0.01)，提示去卵巢手術+高脂血癥模型對大鼠脂質代謝的影響更大。實時定量PCR結果顯示，模型1組和模型2組比空白組ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA表達量明顯降低，可能是雌性高脂血癥大鼠患病后脂質轉運相關受體ABCA1等減少。模型2組與模型1組相比，ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA表達量降低更顯著(P<0.01)，推測去卵巢手術后雌激素下降影響脂代謝，導致小窩蛋白(CAV1)、脂質轉運受體(LDLR、VLDLR、SR-B1和 ABCA1) 、高密度脂蛋白結構蛋白(ApoA1)mRNA的相對表達量降低幅度更大，提示模型2組可能由于去卵巢手術后雌激素的改變使得脂質轉運受阻更嚴重。

綜上，ELISA實驗結果提示造模成功，且去卵巢手術導致雌激素下降使得大鼠高脂血癥更嚴重。實時定量PCR結果提示去卵巢手術對高脂血癥大鼠主動脈的脂質跨膜轉運和脂質沉積等影響更大，推測絕經期可能對高脂血癥女性主動脈脂質代謝的影響。絕經期干預高脂血癥女性的可能機制有待完善，本研究通過去卵巢手術模擬女性絕經期，從分子生物學水平揭示去卵巢手術可影響雌性高脂血癥大鼠主動脈脂代謝相關受體和脂蛋白結構蛋白的mRNA相對表達量和血清血脂含量，推測去卵巢+高脂血癥組大鼠可能脂質代謝受阻更嚴重。為未來開展絕經期干預女性高脂血癥發生與發展的完整分子機制研究奠定基礎，為主動脈粥樣硬化確診的指標選定提供分子生物學依據。