人Carabin基因過表達的9型重組腺相關病毒的構建及功能鑒定

周殿儒，程闊菊，吳 慶，馮勝紅，羅健華，黃 河，羅 云

(1.四川省達州市中西醫結合醫院藥學部，四川 達州 635000 2.陸軍軍醫大學第二附屬醫院麻醉科，重慶 400037)

carabin是Pan等研究學者于2007年發現的一個新的鈣調磷酸酶(calcineurin,CaN))結合蛋白，主要表達于免疫細胞T和B細胞中，因同時可與calcineurin和Ras相互結合及作用，將其命名為carabin[1]。Pan等學者[1]的研究表明，carabin與CaN結合后可負反饋抑制CaN-NFAT通路，與Ras結合可特異性抑制Ras-ERK1/2通路。在人體免疫細胞T和B細胞活化過程中通過負反饋抑制CaN-NFAT通路和抑制Ras-ERK1/2通路阻斷免疫細胞的持續活化，進而阻斷免疫細胞持續活化而導致的過渡免疫，在機體免疫平衡中發揮著非常重要的作用[2～4]。進一步通過蛋白組學研究發現，carabin在人心肌細胞中亦有表達，并在小鼠心肌細胞中得到驗證。通過小鼠carabin基因敲除證實，carabin蛋白可抑制小鼠冠狀動脈左前降支部分結扎誘導的心肌細胞肥大[5]，并提出carabin有望成為臨床在心衰方面診治心肌肥厚的新靶點[6]。我們的前期研究也發現，carabin在缺血/缺氧誘導的人心室肌細胞株AC16及小鼠梗死心臟中表達均顯著降低[7]，提示carabin可能會在心肌梗死方面起到一定作用，但目前尚無相關研究。鑒于此，本研究擬采用選擇性噬心臟9型重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus type 9,rAAV9)，構建人carabin的9型重組腺相關病毒載體(rAAV9-carabin-IRES- ZsGreen)，通過感染人心室肌細胞株AC16，驗證carabin蛋白過表達效果。為carabin蛋白在心肌梗死中的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1細胞株及質粒:293 AAV 細胞株及腺相關病毒載體質粒(深圳百恩維生物科技有限公司)，pUC57- carabin質粒由本實驗室提供。人心室肌AC16細胞株來源于美國模式培養物集存庫( American type culture collection，ATCC)。

1.1.2主要試劑及儀器:DNA引物合成及測序(美國，invitrogen公司)，限制性內切酶EcoRI(NEB,#R0101M)、XhoI(NEB,#R0146M)，T4 DNA Ligase(NEB,M0202L)，胎牛血清FBS(invitrogen,C2027050)，高效轉染試劑盒HET kit(深圳百恩維生物科技有限公司，BW11002)，Bio-Rad凝膠成像系統(Bio-Rad,SYSTEM GelDoc XR+ IM)。

1.2方 法

1.2.1pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen載體構建:將質粒pUC57-carabin和pAAV9-IRES-ZsGreen在37℃水浴中進行EcoRI+XhoI雙酶切。pAAV9-IRES-ZsGreen所得酶切大片段和pUC57-carabin質粒所得酶切目的基因在37℃T4DNA連接酶的作用下連接，所得連接產物在42℃水浴中化學轉化至JM109感受態細胞中，取適量已轉化的感受態細胞涂抹于含Amp+藥液的LB平板上37℃培養過夜，次日于陽性平板上挑選單克隆菌落，接種于含Amp+藥液的培養液中培養24h，提取JM109質粒、EcoRI和XhoI雙酶切、DNA凝膠電泳鑒定目的基因陽性后，送invitrogen公司測序驗證。

1.2.2rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相關病毒的包裝、擴增及滴度測定:用高效轉染試劑盒(HET Kit)將攜帶目的carabin基因的重組質粒pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen導入293AAV細胞接種于10cm培養皿中，導入4-6h后更換新鮮的完全培養基，48h后收集上清液，剩余細胞于-80℃和37℃環境下反復凍融三次，高速離心后收集上清液，與之前上清液合并即為病毒原液。利用病毒原液感染293AAV細胞行連續三代病毒擴增，合并病毒液、純化、濃縮。取20μL濃縮病毒液，提取病毒DNA，行Q-PCR檢測病毒滴度。

1.2.3rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen功能鑒定:取AC16細胞接種于細胞培養瓶中，當細胞融合至80-90%時加入1×105vg病毒液，孵育6-8h后更換培養液，48h后收集細胞提取蛋白，Western blot 檢測carabin蛋白表達。

2 結 果

2.1pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen載體的構建:DNAMAN分析pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen質粒的中carabin基因序列與NCBI中提供的carabin序列一致(見圖1)，表明pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen載體構建成功。

圖1 carabin基因的部分序列

2.2rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen包裝、收毒、擴增及滴度測定:將制備的重組質粒pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen轉染293AAV細胞后，換液48h后進行收毒。取病毒濃縮液提取病毒DNA，行Q-PCR檢測病毒滴度，rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen滴度為：5.09E+12 vg/mL。(見圖2、3)。

圖2 pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen轉染293 AAV細胞后48h(換液后)綠色熒光(左)與白光(右)對照圖(×100)

圖3 rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen Q-PCR滴度檢測A：標準品擴增曲線；B：rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen擴增曲線；C：標準品標準曲線

2.3rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen 功能鑒定:將構建成功的rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen 感染人心室肌細胞株AC16，72h后提取總蛋白，western blot驗證carabin過表達成功，結果見圖4、5。

圖4 rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen轉染AC16細胞后72h(換液后)綠色熒光(左)與白光(右)對照圖

圖5 rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen 在人心室肌細胞株AC16內的過表達效應(+s,n=9)注：與正常組相比較，*P<0.05

3 討 論

carabin是Pan等研究學者[1]于2007年新發現的一個鈣調磷酸酶(calcineurin,CaN)結合蛋白，因同時可與calcineurin和Ras結合將其命名為carabin。經結合結構域鑒定，carabin蛋白CaN結合域位于羧基端，Ras結合域位于氨基端。CaN結合域的最小結合域為羧基末端(aa406-446)的41個氨基酸殘基；Ras結合域的最小結合域為氨基端未端(aa89-294)的206個氨基酸殘疾[1]。離體和在體實驗的結合域功能鑒定表明：①CaN 結合域 ：carabin的核酸轉錄依賴于CaN- NFAT信號通路的活化，而后生成的carabin蛋白又通過其自身的CaN結合域結合CaN，反過來抑制CaN-NFAT信號通路，因此carabin是CaN-NFAT信號通路的負反饋抑制蛋白；②Ras結合域：carabin的氨基端具有Ras GAP活性，能特異性抑制Ras-ERK1/2信號通路。研究顯示，在人體免疫細胞T和B細胞中，carabin 通過反負饋抑制CaN-NFAT信號通路和抑制Ras-ERK1/2信號通路阻斷T細胞及B細胞的持續活化，從而避免免疫持續活化后對機體的傷害，以維持機體的免疫平衡狀態[1～4]。經蛋白質譜鑒定，carabin在人、小鼠及大鼠心肌細胞中也有表達。并有研究顯示，在小鼠心臟中，carabin可通過CaN-NFAT、Ras-ERK1/2及Ras- CaMKII信號通路抑制由冠狀動脈左前降支部分結扎誘導的心肌肥大[5]。因此，在此基礎上有學者提出carabin有望在心衰領域成為診治心肌肥厚的新靶點[6]。

我們的早期研究發現，在小鼠心肌梗死動物模型中，carabin的mRNA和蛋白表達水平在術后第7天及14天的心臟梗死區域均顯著下調(約7倍)；同時在缺血/缺氧誘導的人心室細胞株AC16中發現，carabin的mRNA和蛋白表達水平亦顯著下調[7]。因此我們設想carabin可能會在心肌梗死中起到一定的作用，但目前尚無相關文獻報道。 如前所述，carabin是一個新發現的蛋白，目前尚無特異性激動劑。鑒于此，本研究利用了對心肌細胞具有特異性選擇的腺相關病毒rAAV9載體，插入人carabin基因，以此達到能選擇性在心肌細胞中過表達carabin蛋白的作用，為進一步研究carabin在心臟中的作用奠定研究基礎。

近年來，分子生物學技術的迅速發展推動著分子醫學的不斷進步，各種基因過表達及干擾手段不斷成熟及簡化。當前，用于基因干預的方法主要有質粒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒導入。腺相關病毒是近幾年發展起來的新型基因導入載體，具有對所有哺乳類細胞感染的能力，并能在體內長期存在具有表達能力，且沒有致病性，同時根據不同分型對不同細胞具有選擇性[8]。根據其病毒衣殼的不同共有10余種血清型，每種血清型對不同的組織及細胞具有不同的親和性，其中rAAV9對心臟具有高度親和性，因此具有選擇性感染心臟組織的能力[9,10]。因此，將目的基因構建進rAAV9病毒中，則可實現對心臟組織特異性過表達的目的，為后期在體實驗研究carabin信號通路在心肌細胞中的作用奠定基礎。

在rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen構建過程中，我們首先將人carabin基因定向克隆至pAAV9-IRES-ZsGreen載體形成pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen重組質粒 ，經測序驗證后轉染293 AAV 細胞，所合成病毒原液經反復擴增收毒、純化及濃縮后測定病毒滴度，感染人心室肌細胞株AC16行rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen功能鑒定，western blot驗證carabin過表達成功，說明rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen構建成功。rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen的成功構建為后期carabin在心肌梗死及缺血中的作用機制研究奠定了實驗基礎。