復方芪參提取物對糖尿病足潰瘍模型大鼠創面愈合及HIF-1α/VEGF/VEGFR2通路的影響

于澤洋，李天博，王江寧

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院矯形外科，北京 100038)

糖尿病(DM)是全球普遍存在的健康問題。2000年全球約有1.71億人患有DM，這一數字預計到2030年將增加近一倍[1]。據估計，DM患者中有15%至25%在其一生中會患上足部潰瘍，嚴重影響其生活質量，可能危及生命，這也是大部分糖尿病患者住院的原因。糖尿病足潰瘍(DFU)構成嚴重感染和截肢的重大風險，在發達國家和發展中國家都構成主要的公共衛生負擔。與需要截肢的DFU相關的5年死亡率為39%至80%，其已經非常接近最具侵略性的癌癥。因此，正在不斷研究促進糖尿病足疾病治愈的新方法，以降低發病率和死亡率。局部新血管形成減少和外周血流減少是導致DFU傷口愈合延遲的關鍵因素。大量證據表明，缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)/血管內皮生長因子(VEGF)信號的功能受損是與糖尿病相關的血管生成受損的主要機制[2]。HIF-1α是氧穩態的主要調節劑，在正常的氧條件下，HIF-1α迅速羥基化和降解并翻譯，這是由HIF脯氨酰羥化酶(PHD)的氧依賴性酶家族介導的[3]。在缺氧的組織條件下，PHD減少了HIF-1α的羥基化作用，其結果是HIF-1α蛋白得以穩定并啟動了多個對血管生成至關重要的基因的表達，最顯著的是VEGF[4,5]。在糖尿病患者中，HIF-1α的功能活性降低。這種變化導致傷口無法響應軟組織缺血而下調VEGF，從而導致血管生成和傷口愈合受損。復方芪參提取物是一種新型的口服活性藥物，在貧血中發揮作用的基本機制涉及其介導的HIF-1α的瞬時穩定。此外，復方芪參提取物還具有益氣活血，化瘀止痛的功效。目前尚無報道復方芪參提取物在血管生成和糖尿病傷口愈合中的功能。因此，本研究擬探討復方芪參提取物對糖尿病足潰瘍模型大鼠創面愈合及HIF-1α/VEGF/血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)通路的影響，為糖尿病足潰瘍的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物:SPF級成年SD大鼠，雌雄各半，7～8周齡，體重200～250g，購自河北省實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(冀)2020-0001，動物使用許可證號：SYXK(冀)2020-0003，動物質量合格證號：HBHG2020041603，大鼠飼養環境為：溫度(22～26℃)、光照(12h:12h光照/黑暗循環)、濕度60%～70%。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2主要藥物、試劑與儀器:復方芪參提取物(原料藥，純度98.5%，河南省新誼藥業股份有限公司，批號CSA1019)；鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，規格0.85g/片，批號20200109)；高糖高脂飼料(上海帆泊生物技術有限公司，批號K00019)；鏈脲佐菌素(STZ)(南京沃博生物科技有限公司，批號M5623)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物技術研究所，批號C0904L)；TRIzol試劑(美國Ambion公司，批號WE471-36)；PrimeScript RT Master Mix逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司，批號471UY)；SYBR Green I Master Mix熒光定量PCR試劑盒(北京生東科技有限公司，批號A25741)；RIPA裂解緩沖液(美國Sigma-Aldrich公司，批號SA748536)；BCA蛋白質測定試劑盒(美國Thermo Fisher公司，批號KK4156)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(廈門慧嘉生物科技有限公司，批號PPJC0517)；HIF-1α、VEGF、VEGFR2、GAPDH單克隆抗體、羊抗鼠二抗(北京普利萊基因技術有限公司，批號C2168-50、C1782-50、C1779-100、C1319-100、PL10016)；ECL化學發光液(上海李記生物科技有限公司，批號AP34L029)；ImageJ軟件(美國國立衛生研究院)；CX21BIM-SET5型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；StepOnePlus型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；ChemiDoc XRS +型凝膠成像分析系統(美國伯樂公司)。

1.3造模、分組及給藥:71只大鼠適應性喂養1周后進行實驗，隨機選取12只大鼠作為對照組喂以普通飼料，其它59只大鼠喂以高糖高脂飼料，喂養4周后，對照組大鼠一次性腹腔注射0.1moL/L的檸檬酸鈉緩沖液，其它59只大鼠一次性腹腔注射STZ(60mg/kg，溶解在pH 4.5的0.1moL/L檸檬酸鈉緩沖液中)，并于72h后檢測血糖水平，空腹血糖水平≥16.7mmoL/L的大鼠為糖尿病模型大鼠[6]。59只大鼠成功造模48只，將48只糖尿病模型大鼠按隨機數字表法分為模型組、二甲雙胍組(0.2g/kg)、復方芪參提取物低劑量組(4g/kg)、復方芪參提取物高劑量組(8g/kg)，每組12只。隨后將對照組、模型組、二甲雙胍組、復方芪參提取物低劑量組、復方芪參提取物高劑量組大鼠通過腹腔注射4%的水合氯醛麻醉，在無菌條件下使用5mm皮膚活檢打孔器在大鼠背側后足形成單個圓形全層皮膚潰瘍創面傷口，以建立糖尿病足潰瘍模型大鼠[7]。造模成功后第1天，二甲雙胍組大鼠灌胃0.2g/kg的二甲雙胍[8](將二甲雙胍在生理鹽水中溶解，配制成濃度0.02g/mL的溶液，灌胃體積10mL/kg)；復方芪參提取物低劑量組、復方芪參提取物高劑量組大鼠分別灌胃4g/kg、8g/kg的復方芪參提取物[8](將復方芪參提取物在生理鹽水中溶解，配制成濃度分別為0.4g/mL、0.8g/mL的溶液，灌胃體積10mL/kg)；對照組和模型組大鼠灌胃10mL/kg的生理鹽水；每天灌胃1次，連續給藥4周。

1.4大鼠潰瘍創面愈合率的測定:分別于造模完成后和給藥結束后對創面照相，并通過ImageJ軟件測量創面面積，使用以下公式確定創面愈合情況：創面愈合率=(造模完成后創面面積-給藥周期結束后創面面積)/造模完成后創面面積×100%。

1.5糖尿病足大鼠和正常大鼠潰瘍創面組織病理觀察:腹腔注射4%的水合氯醛麻醉大鼠，分別獲取糖尿病足大鼠和正常大鼠潰瘍創面組織，常規HE染色，觀察大鼠潰瘍創面病理情況。

1.6糖尿病足大鼠和正常大鼠潰瘍創面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平測定:取1.5中剩余的創面組織，使用TRIzol試劑提取組織中的總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒進行逆轉錄程序合成cDNA，使用實時熒光定量PCR儀和SYBR Green I Master Mix熒光定量PCR試劑盒進行實時PCR，引物由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。引物序列如下：HIF-1α正向5'-CTGTGCATGCACAGAAGTGTGTGCTA-3'，HIF-1α反向5'-TGTGACTGACTTGCGCTCGACTGTAG-3'；VEGF正向5'-TGTGACTGACTTGCTGTGTGTCGTA-3'，VEGF反向5'-GTACTACCTGGCTCTGTGTGCGCGT-3'；VEGFR2正向：5'-TGTACGTGAAGCATGCCGTGACCGTA-3'，VEGFR2反向：5'-GGTGACGTGATTTTCTGTTCGTTACAC-3'；β-actin正向：5'-TTGTGACGTGACGCGAGATGTGCGT-3'，β-actin反向：5'-CTGTGCGTGACGTACAGGTTGTGCG-3'。PCR擴增條件如下：95℃持續1min，然后進行40個75℃持續10s和60℃持續20s的循環。并使用2-ΔΔCt方法分析HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA表達水平，β-actin作為內參對照。

1.7糖尿病足大鼠和正常大鼠潰瘍創面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平測定:取1.5中剩余的創面組織，在RIPA裂解緩沖液中裂解，使用BCA蛋白質測定試劑盒確定蛋白質濃度，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(30μg)，并轉移到PVDF膜上，然后在TBST緩沖液中用5%脫脂奶粉封閉膜2h，并與HIF-1α(1∶1000)、VEGF(1∶1000)、VEGFR2(1∶1500)、GAPDH(1∶1500)一抗孵育過夜，之后與羊抗鼠二抗(1:5000)孵育1h，加入ECL化學發光液，收集蛋白帶圖像，并用凝膠成像分析系統分析相對光密度。

2 結 果

2.1各組大鼠潰瘍創面愈合率比較:與對照組比較，模型組大鼠創面愈合率降低(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組、復方芪參提取物低、高劑量組大鼠創面愈合率升高(P<0.05)，且復方芪參提取物高劑量組大鼠創面愈合率高于復方芪參提取物低劑量組(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，復方芪參提取物低劑量組大鼠創面愈合率降低(P<0.05)，復方芪參提取物高劑量組大鼠創面愈合率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠潰瘍創面愈合率比較

2.2各組大鼠潰瘍創面組織病理學比較:對照組創面組織結構正常，可見大量成纖維細胞及毛細血管；模型組創面組織大量炎癥細胞浸潤，成纖維細胞及毛細血管數目明顯減少；二甲雙胍和復方芪參提取物干預后，創面組織成纖維細胞及毛細血管增加，炎癥細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 各組大鼠潰瘍創面組織病理圖(HE染色，×200)注:A：對照組，B：模型組，C：二甲雙胍組，D：復方芪參提取物低劑量組，E：復方芪參提取物高劑量組

2.3各組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平比較:與對照組比較，模型組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組相比，二甲雙胍組、復方芪參提取物低、高劑量組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平升高(P<0.05)，且復方芪參提取物高劑量組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平高于復方芪參提取物低劑量組(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，復方芪參提取物低劑量組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平降低(P<0.05)，復方芪參提取物高劑量組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α VEGF VEGFR2 mRNA水平比較

2.4各組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平比較:與對照組比較，模型組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組相比，二甲雙胍組、復方芪參提取物低、高劑量組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平升高(P<0.05)，且復方芪參提取物高劑量組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平高于復方芪參提取物低劑量組(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，復方芪參提取物低劑量組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平降低(P<0.05)，復方芪參提取物高劑量組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α VEGF VEGFR2蛋白水平比較

圖2 各組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2蛋白水平表達注A：對照組，B：模型組，C：二甲雙胍組，D：復方芪參提取物低劑量組，E：復方芪參提取物高劑量組

3 討 論

糖尿病足潰瘍是全世界重要的衛生保健負擔。據估計，每年約有912-2610萬人患此病。糖尿病足潰瘍的中位愈合時間長達12周，與截肢風險高度相關。局部新生血管形成減少和外周血流減少是導致糖尿病患者傷口愈合延遲的關鍵因素。由于氧氣和營養物質的轉移不足，廣泛的微血管病會延遲細胞浸潤、膠原蛋白合成、血管生成、肉芽組織形成和再上皮形成。有研究證實，復方芪參提取物可抑制肝癌進展[9]。復方芪參提取物主要成分為黃酮類、異黃酮類、生物堿、三萜類植物，這些成分對糖尿病傷口愈合的促進作用有廣泛的研究[10]。復方芪參提取物作為促進糖尿病傷口愈合的潛在療法具有多種優勢，除其促進血管生成作用外，據報道復方芪參提取物還可以改善表皮干細胞的增殖和運動能力，加速角質形成細胞的再上皮形成，從而促進皮膚傷口的愈合[11]。本研究結果發現：與模型組相比，二甲雙胍組、復方芪參提取物低、高劑量組大鼠創面愈合率升高，創面組織成纖維細胞及毛細血管增加，炎癥細胞浸潤減少。這說明，復方芪參提取物可促進糖尿病足潰瘍模型大鼠創面愈合，減輕創面炎癥反應，與上述研究結論相符。

糖尿病傷口的延遲愈合特性是由于缺氧導致新生血管形成受損的結果。研究報道了新生血管形成受損的潛在機制是缺氧誘導的VEGF表達降低，這是由于HIF-1α的反式激活所致[12]。這種變化是由于高糖暴露降低了HIF-1α結合其共激活因子p300，主要原因是活性氧簇(ROS)誘導的乙二醛酶1底物(甲基乙二醛)對p300的修飾而引起的。證明高血糖通過干擾HIF-1α的穩定性，從而抑制HIF-1α和其下游基因VEGF的表達。因此，HIF-1α/VEGF信號功能受損被認為是糖尿病足患者血管生成受損和傷口愈合延遲的主要原因[13]。研究證明，HIF-1α的穩定對于逆轉這種病理過程至關重要[14]。高壓氧(HBO)療法激活了HIF-1α，其目標基因VEGF和VEGFR2以及局部HIF-1α在糖尿病傷口中的轉移與HBO有協同作用。此外，細胞實驗表明，二甲基草酰甘氨酸可上調HIF-1α，改善血管生成并顯著加速糖尿病創面愈合過程[15]。本研究結果顯示，使用二甲雙胍和復方芪參提取物治療后，二甲雙胍組、復方芪參提取物低、高劑量組大鼠潰瘍創面組織HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白水平高于模型組。這說明，復方芪參提取物促進糖尿病足大鼠潰瘍創面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達，進而激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2通路，從而促進糖尿病足潰瘍模型大鼠創面愈合，與上述研究結果一致。

綜上所述，復方芪參提取物可促進糖尿病足潰瘍模型大鼠創面愈合，其機制可能與復方芪參提取物促進大鼠糖尿病足潰瘍創面組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表達，進而激活HIF-1α/VEGF/VEGFR2通路有關。