MFC監測MRD在AML形態學緩解患者中的應用價值

王 楠，馮硯平，陳 康，傅 強，王偉佳

廣東省中山市人民醫院檢驗醫學中心，廣東中山 528400

急性髓系白血病(AML)是一種惡性、異質性、克隆性疾病，具有高度基因復雜性。通過聯合化療誘導緩解后，80%的AML患者可以達到形態學完全緩解(mCR)，但是超過50%的成年患者會復發，這與化療后微小殘留病灶(MRD)的增殖有關。所以，尋找采用傳統形態學方法無法觀察到的MRD，對于指導臨床治療策略，改善疾病預后，延長患者生存期具有重要意義。多參數流式細胞術(MFC)通過使用熒光染料標記的單克隆抗體組來評估造血細胞的抗原表達，識別白血病相關免疫表型(LAIP)，可廣泛應用于90%的AML患者，且檢測速度快，靈敏度高[1]。本研究對138例經誘導化療后達到mCR的AML患者進行了相關分析，應用MFC監測患者骨髓標本的MRD,分析其在AML復發與預后評估中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月至2019年5月本院收治的經過1～2個療程誘導化療后達到mCR的AML患者(排除M3型)138例。所有患者均進行骨髓形態學、細胞遺傳學、免疫表型、分子生物學檢查，按照世界衛生組織(WHO)和FAB標準進行確診和分型,參照2019年美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)AML相關標準進行危險分層[2]。

1.2方法

1.2.1治療方案及療效判斷 白細胞水平過高的患者首先使用羥基脲或聯合白細胞單采清除術降低白細胞水平。根據患者的年齡及各方面情況，采用IA、HAA、MA、TA、CAG及DCAG等方案進行誘導化療。根據治療效果及遺傳學危險分層，預后良好的患者鞏固化療6～8個療程，預后不良的患者在完全緩解后進行異基因造血干細胞移植，若無移植條件，則采用聯合化療。參照《血液病診斷及療效標準》進行療效判斷，分為完全緩解、部分緩解、無效。

1.2.2MFC檢測MRD 根據初診時每個患者的免疫分型結果確定相應的LAIP，以此作為MRD檢測的標志。于每次化療后3周左右或下次化療前抽取患者骨髓，采用MFC進行MRD檢測(流式細胞儀由美國Becton-Dickinson公司生產)。以CD45/SCC設門，獲取10 000～20 000個細胞，所使用的單克隆抗體包括cMPO、CD13、CD33、CD117、CD34、CD38、CD14、CD15、CD11b、HLA-DR、CD19、CD20、cCD22、cCD79a、CD2、CD3、CD4、CD8、CD7、CD10等，設定具有LAIP的細胞>0.1%為MRD陽性[3]。

1.3隨訪 采用查閱患者門診、住院病歷及電話聯系等方式進行隨訪，隨訪日期截止2020年3月31日。總生存期定義為患者從確診至死亡或隨訪截止的時間，無復發生存期定義為患者從mCR至復發或隨訪截止的時間。

2 結 果

2.1患者臨床特征 138例患者中，MRD陽性31例，占22.5%。MRD陽性與MRD陰性患者性別、年齡、初診時白細胞計數(WBC)、初診時血紅蛋白(HB)、初診時血小板計數(PLT)、初診時乳酸脫氫酶(LDH)水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。在化療第1療程達到mCR的患者中，MRD陰性有89例(83.2%)，MRD陽性有16例(51.6%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 MRD陽性與MRD陰性患者的臨床特征比較

組別n初診時PLT[M(P25,P75),×109/L]初診時LDH[M(P25,P75),U/L]是否在化療第1療程達到mCR[n(%)]是否MRD陽性3135(10,62)444(275,589)16(51.6)15(48.4)MRD陰性10743(23,69)392(285,659)89(83.2)18(16.8)t/χ2/Z1.4220.60213.162P0.1550.547<0.001

2.2MRD陽性與陰性患者的療效及生存分析 經過2～3個療程化療后，所有患者均達到mCR。中位隨訪時間為26個月，MRD陽性患者累計復發率為61.3% ，高于MRD陰性患者的48.6%(χ2=4.407，P=0.036)；MRD陽性患者總生存率為54.8%，低于MRD陰性患者的70.1%(χ2=4.332，P=0.037)；MRD陽性患者的無復發生存率為38.7%，低于MRD陰性患者的49.5%(χ2=4.408，P=0.035)。Kaplan-Meier生存曲線見圖1。

注：A為累計復發率；B為總生存率；C為無復發生存率。

2.3MRD陽性患者接受不同治療方案后的生存情況 31例MRD陽性患者在誘導緩解后有19例繼續采用鞏固化療，12例接受異基因造血干細胞移植。鞏固化療患者總生存率為47.4%，低于異基因造血干細胞移植患者的66.7%(χ2=4.190，P=0.041)。Kaplan-Meier生存曲線見圖2。

圖2 鞏固化療患者與異基因造血干細胞移植患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

AML是一種具有高度異質性、進展快的血液系統惡性腫瘤。目前，隨著醫療水平的快速提高及大量新藥的研發應用，AML患者的完全緩解率明顯提高，生存期延長。但仍有半數以上的患者會在緩解后一段時間內復發，導致生存期縮短，最終死亡，其主要原因是在達到mCR后骨髓中的MRD持續存在且出現增殖，導致AML復發。所以，MRD監測在指導個性化治療、更早發現藥物耐藥性、預測復發，以及評價治療效果等方面均具有重要意義[4]。目前，臨床常用的定量檢測MRD的方法包括MFC檢測LAIP和實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測特異性融合基因。RT-qPCR的優點是靈敏度和特異度高，但是通常用于檢測特定遺傳學及分子學異常的患者所存在的融合基因及基因突變[5]，如PML-RARA、RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH1等融合基因及NPM1、FLT3等基因突變等，而存在這些遺傳學及分子學異常的患者僅占所有AML患者的60%～70%[6]，因此該方法存在一定的局限性。MFC可以識別每個患者獨特的LAIP，并將其作為該患者的MRD在后續樣本檢測中進行追蹤，可廣泛應用于90%的AML患者，且采用MFC檢測MRD的靈敏度較高。

國內外多項研究肯定了MRD在AML mCR患者中的預后意義[7-10]。FREEMAN等[7]使用MFC評估2 450例成年AML患者MRD的研究指出，首次誘導化療后MRD陽性患者與化療后部分緩解患者的生存結局類似，特別是在中風險及高風險患者中；對于NPM1野生型中風險患者，兩個療程化療誘導后，MRD陽性與不良預后顯著相關。張瑩等[8]對131例AML患者的研究顯示，在獲得mCR后接受鞏固化療的患者中，MRD陽性患者的5年總生存率和無復發生存率明顯低于MRD陰性患者。本研究結果顯示，MRD陽性患者累計復發率高于MRD陰性患者，總生存率和無復發生存率低于MRD陰性患者，與上述報道相似。

目前，對AML患者治療前進行風險分層主要根據年齡、遺傳學及分子學等，MRD對預后的重要意義提示可將其作為治療后危險分層的參考依據，可根據AML治療后MRD的狀態來進行危險分層，并指導臨床個性化治療。以MRD為依據的危險分層相關研究大多數是針對急性淋巴細胞白血病(ALL)的，ZUGMAIER等[11]的研究發現，在3次強化治療后完全緩解但MRD陽性的前體B-ALL患者中，經過靶向CD19+的博納吐單抗治療后，與MRD轉陰的患者相比，MRD未轉陰患者的總生存率、無復發生存率更低，緩解期更短。目前，在AML中以MRD為基礎指導危險分層治療的研究較少，1項國外的前瞻性臨床試驗將AML患者細胞遺傳學和MFC聯合用于評估鞏固化療后MRD的情況，用來指導患者的緩解后治療，結果顯示，在鞏固化療后MRD陽性的中風險患者中，異基因造血干細胞移植可以延長總生存期及無復發生存期，使其與MRD陰性患者的生存結局接近[12]。本研究也發現，MRD陽性患者中，鞏固化療患者總生存率低于異基因造血干細胞移植患者，說明異基因造血干細胞移植可以改善MRD陽性患者的預后，延長其生存時間。

綜上所述，mCR后MRD陽性患者復發率高，采用MFC監測AML患者mCR后的MRD對患者預后具有重要意義，可以早期發現易復發患者，為個性化地制訂緩解后治療方案提供依據。但目前以MRD為依據指導臨床干預措施這一觀點仍需要大量的前瞻性研究來證明。