56 ℃ 30 min熱滅活新型冠狀病毒對輸血相容性檢測結(jié)果的影響

郭 黠，蒯迪文

湖南省岳陽市二人民醫(yī)院輸血科，湖南岳陽 414000

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm，其基因特征與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)及中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)有明顯區(qū)別[1]。SARS-CoV-2對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，但氯己定不能有效滅活病毒[1]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)潛伏期1～14 d，多為3～7 d;傳染源主要是COVID-19患者，無癥狀感染者也可能成為傳染源;主要傳播途徑為經(jīng)呼吸道飛沫傳播和密切接觸傳播，在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠的情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能,人群普遍易感[1]。SARS-CoV-2具有很強(qiáng)的傳染性和致病性，對確診或疑似為COVID-19的患者標(biāo)本進(jìn)行輸血相容性檢測時，必須在具有生物安全柜和二級安全防護(hù)的條件下進(jìn)行。但受條件限制，很多基層醫(yī)院實(shí)驗室尚未達(dá)到相關(guān)防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)送檢標(biāo)本中存在未診斷或無癥狀的COVID-19患者標(biāo)本時，因缺乏防護(hù)措施，很有可能造成SARS-CoV-2在實(shí)驗室中的傳播。因此，在進(jìn)行輸血相容性檢測前首先對醫(yī)院送檢的所有患者的血液標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2滅活處理，再對滅活后的標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)輸血相容性檢測，可突破普通實(shí)驗室條件的限制，消除實(shí)驗室工作人員在檢測中的感染風(fēng)險。本研究通過對標(biāo)本加熱56 ℃ 30 min，模擬滅活SARS-CoV-2的條件，分析滅活前后紅細(xì)胞血型抗原強(qiáng)度、抗體效價的變化，探討SARS-CoV-2熱滅活處理對輸血相容性檢測的影響，為今后在普通實(shí)驗室條件下通過熱滅活病毒開展輸血相容性檢測提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 標(biāo)本1：從普通住院患者血液標(biāo)本中選取20份A型血、20份B型血和20份O型血標(biāo)本進(jìn)行血型檢測。標(biāo)本2：從獻(xiàn)血者留樣血辮中隨機(jī)選取3份A型血(編號1～3)、3份B型血(編號4～6)標(biāo)本，以及從住院患者血液標(biāo)本中選擇1份經(jīng)鑒定含IgM型抗-M的標(biāo)本(患者1)進(jìn)行IgM型抗-A、抗-B和抗-M效價檢測。標(biāo)本3：從獻(xiàn)血者留樣血辮中隨機(jī)選取3份O型血(編號7～9)標(biāo)本，以及從住院患者血液標(biāo)本中選擇1份經(jīng)鑒定含IgG型抗-E的標(biāo)本(患者2)進(jìn)行IgG型抗-A、抗-B和抗-E效價檢測。

1.2儀器與試劑 FYQ免疫微柱孵育器、TD-3A型血型血清學(xué)用離心機(jī)(長春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司)，KA-2200血清學(xué)專用離心機(jī)(日本久保田公司)，56 ℃恒溫水浴箱。ABO、RhD血型定型檢測卡(單克隆抗體)、抗人球蛋白微柱凝膠卡(長春博迅生物技術(shù)有限公司)。單克隆抗-A、抗-B血型定型試劑(北京金豪制藥股份有限公司，批號：20191000705)，單克隆RhD(IgM)血型定型試劑(北京金豪制藥股份有限公司，批號：20191001105)，二巰基乙醇(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號：20187702)，抗體鑒定譜細(xì)胞(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號：20191205)。A、B型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞由本科室新鮮自配。檢測抗-A、抗-B效價使用的紅細(xì)胞為本科室自配的A、B型新鮮紅細(xì)胞，試管法凝集強(qiáng)度≥++++；檢測抗-M效價使用的是抗體鑒定譜細(xì)胞中M抗原為純合子的2號細(xì)胞和5號細(xì)胞混合液；檢測抗-E效價使用的是抗體鑒定譜細(xì)胞中E抗原為純合子的1號細(xì)胞和6號細(xì)胞混合液。

1.3方法

1.3.1紅細(xì)胞ABO、RhD血型抗原檢測 將標(biāo)本1中所有標(biāo)本均分裝為2管，1管分別用試管法、微柱凝集法鑒定其血型，記錄其凝集強(qiáng)度并計算積分；另1管進(jìn)行56 ℃ 30 min熱滅活處理，待冷卻離心后分別用試管法、微柱凝集法鑒定其血型，記錄其凝集強(qiáng)度并計算積分,判讀標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 ABO、RhD血型鑒定凝集強(qiáng)度積分

1.3.2IgM型抗-A、抗-B和抗-M效價檢測 將標(biāo)本2中所有標(biāo)本均分裝為2管，1管進(jìn)行56 ℃ 30 min熱滅活處理，離心，然后取50 μL用生理鹽水按1∶32的比例稀釋，加入對應(yīng)的3%標(biāo)準(zhǔn)A型、B型或O型紅細(xì)胞懸液50 μL，混勻。另1管取出50 μL后不進(jìn)行熱滅活，直接用生理鹽水按1∶32的比例進(jìn)行稀釋，然后加入對應(yīng)的3%標(biāo)準(zhǔn)A型、B型或O型紅細(xì)胞懸液50 μL，混勻，1 000×g離心15 s，觀察并記錄試管法凝集強(qiáng)度。

1.3.3IgG型抗-A、抗-B和抗-E效價檢測 將標(biāo)本3中所有標(biāo)本均分裝為2管，1管進(jìn)行56 ℃ 30 min熱滅活處理，離心,然后取100 μL按1∶1的比例加入等量的二巰基乙醇，37 ℃溫育15 min破壞IgM抗體，離心,然后取出50 μL用生理鹽水按1∶32的比例稀釋，每管加入對應(yīng)的3%標(biāo)準(zhǔn)A型、B型或O型紅細(xì)胞懸液50 μL，混勻。另1管不進(jìn)行熱滅活，離心后取100 μL按1∶1的比例加入等量的二巰基乙醇，37 ℃溫育15 min破壞IgM抗體后取出50 μL，用生理鹽水按1∶32的比例進(jìn)行稀釋，然后加入對應(yīng)的3%標(biāo)準(zhǔn)A型、B型或O型紅細(xì)胞懸液50 μL，混勻。最后分別加入抗人球蛋白微柱凝膠卡，孵育離心后觀察并記錄凝集強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1紅細(xì)胞ABO、RhD血型抗原檢測結(jié)果 56 ℃ 30 min熱滅活后，試管法ABO、RhD血型鑒定凝集強(qiáng)度積分與未進(jìn)行熱滅活相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；56 ℃ 30 min熱滅活后，微柱凝集法ABO、RhD血型鑒定凝集強(qiáng)度積分與未進(jìn)行熱滅活相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 ABO、RhD血型鑒定凝集強(qiáng)度積分分)

血型n56 ℃ 30 min熱滅活試管法抗-A抗-B抗-D微柱凝集法抗-A抗-B抗-DAcBcO型20--5.45±1.10*--10.60±0.9410.00±0.929.80±0.62A型2010.00±0.92*-5.30±1.22*12.00±0.00-10.60±1.14-9.30±0.98B型20-10.10±0.79*5.50±1.32*-11.90±0.4510.50±0.899.50±0.89-

2.2IgM型抗-A、抗-B和抗-M及IgG型抗-A、抗-B和抗-E效價檢測結(jié)果 56 ℃ 30 min熱滅活與未進(jìn)行熱滅活的IgM型抗-A、抗-B、抗-M效價和IgG型抗-A、抗-B效價檢測結(jié)果完全相同；56 ℃ 30 min熱滅活后IgG型抗-E效價的檢測結(jié)果在允許范圍之內(nèi)。見表3、4。

表3 IgM型抗-A、抗-B和抗-M效價檢測結(jié)果

表4 IgG型抗-A、抗-B和抗-E效價檢測結(jié)果

3 討 論

COVID-19是一種急性呼吸道傳染性疾病，具有很強(qiáng)的傳染性，目前已納入乙類傳染病，并要求按甲類傳染病管理[1]。輸血科工作人員在輸血相容性檢測過程中，直接或間接與各類標(biāo)本接觸，其中就有可能接觸到COVID-19患者的標(biāo)本，由于條件限制，極易因職業(yè)暴露而增加工作人員的感染風(fēng)險。在檢測前先進(jìn)行病毒滅活處理，可消除檢測人員的職業(yè)暴露風(fēng)險。SARS-CoV-2對熱敏感，56 ℃ 30 min可有效滅活病毒，該滅活方法適用于基層醫(yī)療單位[2]，本研究基于此探討了56 ℃ 30 min熱滅活SARS-CoV-2 對輸血相容性檢測結(jié)果的影響。

輸血相容性檢測一般包括血型鑒定和交叉配血，因此，紅細(xì)胞血型抗原強(qiáng)度的變化和血型抗體效價的變化對輸血相容性檢測至關(guān)重要。除了ABO血型抗-A、抗-B外，本研究還選擇了1種IgM型和1種IgG型的不規(guī)則抗體作為代表來檢測效價的變化。抗-M是最常見的IgM型抗體，抗-E是最常見的IgG型抗體[3-5]，所以，本研究選擇這兩種抗體作為不規(guī)則抗體檢測的代表。研究表明，熱滅活處理可能會減弱紅細(xì)胞表面血型抗原的強(qiáng)度，影響試管法血型鑒定的凝集強(qiáng)度，特別是對RhD血型的影響尤其明顯[6]。從本研究結(jié)果來看，經(jīng)56 ℃ 30 min熱滅活處理后，試管法鑒定血型時凝集強(qiáng)度減弱，但并不影響對血型鑒定的最終判定；而使用微柱凝集法鑒定血型時，其凝集強(qiáng)度與未進(jìn)行熱滅活處理時的凝集強(qiáng)度無明顯差異。分析其原因：(1)紅細(xì)胞的A、B抗原為糖類抗原，RhD抗原為蛋白多肽類抗原，在56 ℃熱滅活過程中，隨著時間的延長，其與相應(yīng)抗體的反應(yīng)性有一個逐漸降低的過程，但不至于降到很低；(2)56 ℃熱滅活處理時，隨著孵育時間的延長溶血逐漸加重[6]，但溶血并不會降低血型抗原的抗原性；(3)本研究在熱滅活過程中使用的是全血，血漿對紅細(xì)胞可能有一定的保護(hù)作用，因此，56 ℃ 30 min熱滅活處理對血型鑒定結(jié)果的影響微乎其微。同時，本研究結(jié)果還顯示，56 ℃ 30 min熱滅活處理不會降低血清中抗-A、抗-B、抗-E、抗-M的效價，能保證在輸血前檢測中不會遺漏掉重要的抗體，能一定程度上保障輸血安全性。值得一提的是，在56 ℃ 30 min熱滅活處理后，需要重新離心標(biāo)本再進(jìn)行相關(guān)檢測，以排除變性蛋白對檢測結(jié)果的影響。

綜上所述，通過56 ℃ 30 min熱滅活處理臨床標(biāo)本來預(yù)防SARS-CoV-2的傳播，是一種行之有效的方法，對輸血相容性檢測的影響幾乎可以忽略不計，在一些條件受到限制，防護(hù)措施不完善的基層醫(yī)院可推廣使用，可有效保護(hù)一線檢驗工作人員的人身安全。