MAPKs信號通路在內皮素-1誘導的牙周膜干細胞成骨分化過程中的作用研究

梁莉 許亦權 楊楠 王辰

[關鍵詞]牙周膜干細胞;內皮素-1;絲裂原激活蛋白激酶;Runx2;骨鈣素;牙周炎

牙周炎導致牙槽骨出現損傷，所以骨再生是牙周病診治的重中之重。牙周膜干細胞（Periodontal ligamentstem cells，PDLSCs）作為骨再生的不可忽視的一大細胞[1]。干細胞參與骨再生過程，并且受很多因子影響，內皮素-1（Endothelin-1，ET-1）是多功能因子，在該疾病患者的牙槽骨吸收中起到了不可忽視的效用[2-3]。在之前實驗中了解到ET-1經過絲裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs）信號通路促進PDLSCs的成骨分化，但具體機制尚不清楚[4]。因此，本實驗旨在研究MAPKs信號通路在ET-1調控PDLSCs成骨分化過程中的作用機制，為牙周炎患者骨組織修復再生提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑：內皮素-1（美國Abcam公司），α-MEM培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（FCS），胰蛋白酶（美國Gibco公司），Trizol（Invitrogen公司），Real-time PCR試劑盒（Takara公司），Western blot檢測試劑盒及NC膜為Amersham公司產品。

1.2 體外分離PDLSCs細胞：使用13歲由于正畸原因而拔除的前磨牙患者牙齒，在無菌條件下用PBS反復沖洗牙根表面，收集牙根表面有牙周膜覆蓋部分的牙周韌帶組織，剪碎后用膠原纖維酶消化處理為單細胞懸液。用含FBS的α-MEM培養基培養1周左右，胰酶消化細胞。以每孔0.1ml的濃度將細胞接種于96孔板，隔天換液，1周左右后將具有克隆形成的細胞挑選出，標記為原代細胞。原代細胞繼續接種于培養瓶中，待細胞融合至70%時，按照1：3的比例傳代，取3～4代細胞進行實驗。使用流式細胞儀對已經得到的細胞進行干細胞表面分子標志物測定過程。

1.3 細胞處理：牙周膜干細胞依照1×105/孔的密度在6孔板中進行培養，等待生長12h后，觀察其貼壁情況，使用α-MEM培養基對其培養。次日將孔中的培養液吸出，添加新的培養液，之后在向培養孔中添加MAPK信號通路的三種通路抑制劑，ERK通路抑制劑PD98059，JNK通路抑制劑SP600125，p38α通路抑制劑SB203580。之后再添加100nMET-1，培養2周后，以未作任何處理的牙周膜干細胞為空白對照，以單獨加入抑制劑的牙周膜干細胞為陰性對照，采用實時定量PCR和Western blot檢測各組細胞Runx2和OCN的表達。

1.4 實時定量PCR檢測：用Trizol法抽提細胞總RNA，按試劑盒說明進行反轉錄合成cDNA，用Primer Premier 5設計目的基因、內參基因GAPDH的引物，引物序列（見表1）。PCR擴增條件：95℃預變性30s;95℃ 5s，60℃ 34s，95℃15s，60℃ 60s，95℃ 15s。將GAPDH作為內參對照，將Runx2和OCN基因得值與樣品內參基因得值進行相比，獲得Runx2以及OCN基因相對mRNA表達量值。

1.5 Western blot檢測：取對數生長期細胞，依照常規方法進行裂解，從而獲得蛋白，去其上清檢測其蛋白定量，使用濃度為12% SDS-PAGE凝膠電泳，將其蛋白轉移到PVDF膜，TBST液洗滌印跡膜5min×3次。放入5%脫脂奶粉/TBST封閉液內，室溫封閉1h。加入Runx2、OCN和GAPDH抗體，4℃過夜。棄一抗，TBST洗滌15分鐘/次×3次。加二抗抗體，室溫1h。最后ECL顯色，X線壓片曝光。

1.6 統計學分析：采用統計軟件進行分析處理。實驗數據以x?±s表示。組間比較采用單因素方差分析及LSD-t 檢驗。P <0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 實時定量PCR結果：空白組與陰性組間比較差異無統計學意義（P >0.05）。與空白組和陰性組相比較，ET-1處理組、ET-1+SP組和ET-1+SB組牙周膜干細胞Runx2和OCN mRNA表達顯著增強（P <0.05）;而ET-1+PD組牙周膜干細胞Runx2和OCN mRNA的表達沒有明顯變化（P >0.05）。與ET-1處理組相比較，ET-1+PD組牙周膜干細胞Runx2和OCN mRNA表達顯著降低（P <0.05）。見圖1。

2.2 Western blot檢測結果：結果顯示ET-1明顯增強了PDLSCs組、PDLSCs+SP組和PDLSCs+SB組牙周膜干細胞Runx2和OCN蛋白的表達（P <0.05）;但對PDLSCs+PD組牙周膜干細胞Runx2和OCN蛋白表達沒有顯著影響（P >0.05）。見圖2。

3 討論

隨著人口老齡化的到來，以及國民整體健康水平的提高，牙周健康越來越受關注。牙周炎是影響牙周健康的最常見疾病，會導致牙周結構（如牙槽骨、牙周膜、牙骨質）的破壞引起牙齒活動脫落，是成人牙齒缺少的重要因素[5]。牙周組織修復以及骨再生是這一疾病診治的關鍵所在。

牙周膜干細胞（PDLSCs）是修復牙周組織最有潛力的成體干細胞[6-7]。其在骨組織修復中起到關鍵的作用，并且受多種因子所調控。內皮素-1（ET-1）作為日本研究人員從實驗動物豬的主動脈內皮細胞中得到的一類血管活性肽[8]，研究表明ET-1可誘導成骨細胞形成新骨。ET-1可以刺激前成骨細胞的增殖分化，并通過膜蛋白-聯接蛋白促進成骨細胞的分化。另外，ET-1可增加骨鈣素和骨橋蛋白等基因的整合，刺激堿磷酶的釋放和膠原酶的分泌[9]。ET-1不僅參與了牙周炎患者異常牙周組織改建的病理階段，對牙槽骨的吸收也有著不可忽視的效用[10]。在之前的實驗過程中發現ET-1可以促進了PDLSCs的成骨分化能力，而且MAPKs信號通路參與其中，但調控機制尚不清楚[4]。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）作為絲/蘇氨酸蛋白激酶的一種，在體內中有著很關鍵的作用，可以把信號從細胞表面將其傳遞到到核內，主要包含細胞外信號調控激酶1/2 （extracellular signal regulated kinase1/2，ERK-1/2）、c-jun氨基端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）及p38三部分[11-12]，這三種激酶共同介導著細胞的生長、增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程[13]。其中，ERK在細胞增殖和分化中發揮信號網絡核心的作用。有學者研究發現ERK信號通路能夠促進Runx2等轉錄因子的表達和活性從而促進成骨分化的進程。FGF-2、BMP-2、IGF-1等刺激因子可以通過ERK信號通路調控細胞的成骨分化過程[14-15]。

在本次實驗中，添加ET-1后，PDLSCs的Runx2和OCN的表達程度和對照組相比明顯提升，加入ET-1和ERK通路抑制劑PD98059后，Runx2和OCN的表達水平和只添加ET-1后發生了明顯減少的情況，PD98059（ERK通路抑制劑）能夠對ET-1誘導的PDLSCs Runx2和OCN表達水平產生抑制的作用，但SP600125（JNK通路抑制劑）和SB203580（p38α通路抑制劑）的抑制作用不顯著。結果提示ERK信號通路參與了ET-1誘導的PDLSCs骨向分化過程。

因此，本研究發現ET-1通過ERK信號通路調控牙周膜干細胞的成骨分化能力，為牙周炎患者骨組織修復再生提供理論參考。