匍莖百合的細胞地理學分析

蘇丹美，李 娟，郭先林，何興金，周頌東

(四川大學 生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，成都610064)

匍莖百合(Liliumlankongense)隸屬于百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)，是中國的一個特有百合物種，主要分布于西藏東南部、云南西北部等地，多年生草本植物，花被片反卷，花粉紅色且有深紅色斑點[1]。匍莖百合不僅具有花型優美，具芳香味等較高的觀賞價值，而且由于對亞洲百合雜種系最重要的疾病——葡萄孢疫病具有高度的抗性，被認為是百合園藝品種雜交育種的良好材料[2-5]。近年來，對于匍莖百合的研究主要集中在個別居群的花粉、葉表皮形態、核型和分子系統學[6-10]等方面。

細胞地理學是一門研究染色體的特性及其與植物地理分布之間關系的學科[11]。染色體作為基因的載體，在植物地理分布中具有特殊的重要性，因此細胞地理學也被稱作染色體地理學[12]。核型是體細胞染色體數目、大小、形狀和縊痕相對位置等形態結構的表現[13]，在同一物種不同自然居群間和近緣物種間，可能存在差異，從而導致物種變異或進化。因此，核型可作為推測物種進化途徑、擴散路線和親緣關系的細胞學依據[14-16]，在細胞地理學研究中具有特殊意義[13]。已有許多學者借助種內不同居群的核型探討了物種的種類分化等問題，如長花馬先蒿、康滇假合頭菊、瀘定百合、七筋姑和玉竹[17-21]等，而匍莖百合大多數居群仍缺乏細胞學資料。本研究在匍莖百合各個分布區收集了代表居群8個并希望結合前人報道，對匍莖百合核型數據分析，從細胞地理學方面揭示匍莖百合種內演化趨勢。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

基于匍莖百合的標本記錄，于2018 ～ 2019年在西藏自治區、云南省和四川省野外共收集了匍莖百合8個居群的實驗材料。匍莖百合狹域分布于橫斷山區，在西藏自治區、四川省分別收集了1個居群，在云南省共收集了6個居群。將各居群個體鱗莖分別保存并移栽到花盆中，置于本實驗室的培養室。材料來源及憑證標本保存于四川大學植物標本館SZ(表1)。

表1 匍莖百合8個居群的細胞學材料來源

1.2 實驗方法

待野外采回的鱗莖根尖長至2 ～ 3 cm時，取幼嫩根尖作為實驗材料。具體做法如下：1)上午8：00 ～ 9：00切取根尖1 ～ 2 cm，加入0.1%秋水仙素水溶液與飽和對二氯苯水溶液1∶1混合液于黑暗環境中預處理9 ～ 11 h；2)置于現配的卡諾氏固定液(冰乙酸∶無水乙醇=1∶3)中于4 ℃冰箱中固定過夜；3)轉入至70%乙醇中，置4 ℃冰箱內保存備用；4)1 mol/L鹽酸(60 ℃恒溫水浴)解離12 ～ 15 min；5)改良苯酚品紅染液靜置染色12 min；6)常規壓片，鏡檢。選擇分裂相良好的中期細胞在100倍油鏡下拍照。染色體計數按Levan等[22]方法。每個居群至少取5個分散較好的細胞染色體測量其核型參數。隨體計算在染色體長度之內，以一個居群內觀察到的最高隨體數目作為該居群隨體個數[23]。核型分析和命名采用Levan等[22]方法，核型不對稱性采用Stebbins[24]處理方式。此外，也用Arano[25]提出的不對稱系數As.K%來評估核型不對稱性，As.K%值越高，核型越不對稱。核型數據測量和處理采用軟件MAML 1.0[26]并輔之以手動調整。

2 結果與分析

在本研究中，匍莖百合察隅居群、書松村居群、茨中村居群、蘭坪居群、維西居群、木里居群核型為首次報道，首次發現匍莖百合中存在B染色體。匍莖百合細胞核型比較結果見表2，隨體染色體(satellite chromosome)在核型公式中簡寫為SAT。各居群染色體形態和核型圖見圖版Ⅰ和圖版Ⅱ、核型模式圖見圖版Ⅲ。

圖版Ⅰ 匍莖百合不同居群染色體形態和核型圖A、A′. 察隅居群；B、B′. 茨中村居群；C、C′.書松村居群；D、D′. 貢山居群。箭頭所指表示次縊痕位置，標尺長度10 μmPlate Ⅰ Morphology and karyotype of somatic chromosomes of L. lankongense in different populationsA,A′. Zayü population; B,B′. Cizhong population; C,C′. Shusong population; D,D′. Gongshan population. Black arrows show the secondary constrictions. Scale bar indicating 10 μm

實驗結果表明，8個居群的染色體基數均為x = 12，為二倍體，染色體數目為2n = 2x = 24(表2)。染色體類型包含m、sm、st和t等4種，核型均屬于Stebbins[24]的3B型。不對稱系數As.K%介于81.28% ～ 83.53%，差異較小，察隅居群為最低，木里居群為最高，核型不對稱性強。除了書松村居群臂比值大于2的染色體占全部染色體數的百分比為87.50%外，其他7個居群的百分比均為83.33%。察隅居群、茨中村居群、書松村居群、貢山居群、蘭坪居群、麗江居群、維西居群、木里居群的最長與最短染色體相對長度比值分別為2.18、2.31、2.27、2.18、2.18、2.18、2.19以及2.22，可見除了茨中村居群、書松村居群、木里居群數值稍大外，其他居群最長與最短染色體相對長度比值都接近。8個居群中，2個居群(木里居群和書松村居群)有B染色體；5個居群(察隅居群、茨中村居群、蘭坪居群、維西居群、麗江居群)有隨體，包括居間隨體、短臂隨體和長臂隨體，隨體數目為1 ～ 3(表2，圖版 Ⅲ)。

從核型公式來看(表2)，匍莖百合8個居群的染色體組成可以分為兩大類：一是染色體類型只包括m、st和t三種，如察隅居群、茨中村居群和木里居群；二是染色體包含m、sm、st和t四種類型，如書松村居群、貢山居群、蘭坪居群、麗江居群、維西居群。具備第一類(沒有sm染色體)組成核型的3個居群，其地理分布點幾乎位于同一弧線上(圖1)，并且第1對和第2對染色體類型均是m。染色體類型多樣性呈現出察隅居群、茨中村居群和木里居群這一弧線居群小于這一弧線上緯度向南、向北。

如表2所示，不對稱系數As.K%從小到大排列為：察隅居群(81.28%)、麗江居群(82.07%)、茨中村居群(82.16%)、蘭坪居群(82.25%)、維西居群(82.33%)、貢山居群(82.38%)、書松村居群(82.77%)，木里居群(83.53%)，核型不對稱系數整體上表現為從西到東遞增。如表2，圖版 Ⅲ所示，第3對和第10對染色體上多具有隨體。在核型的隨體特征方面，察隅縣居群在第1對和第10對染色體分別有1條具有短臂隨體和長臂隨體；茨中村居群和維西居群第3對具有居間隨體，第10對染色體有1條具有長臂隨體；蘭坪居群第3對染色體具有居間隨體，第10對染色體其中1條有居間隨體；麗江居群第3對和第10對染色體各有1條居間隨體。不同居群間隨體數量和位置存在差異，隨著從西到東的地理分布，居間隨體增加，隨體數量增加。

圖版Ⅲ 匍莖百合8個居群的核型模式圖A. 察隅居群；B. 茨中村居群；C.書松村居群；D.貢山居群；E.蘭坪居群；F.麗江居群；G.維西居群；H.木里居群Plate Ⅲ Idiograms of 8 populations of L. lankongenseA. Zayü population; B. Cizhong population; C. Shusong population; D. Gongshan population; E.Lanping population; F. Lijiang population; G. Weixi population; H. Muli population

表2 匍莖百合8居群核型參數比較

從染色體類型、核型不對稱系數以及隨體類型分析，匍莖百合核型整體表現為察隅縣-茨中村-木里縣這一條線縣居群染色體類型多樣性小于這一條線上向北、向南分布居群染色體多樣性，從西到東地理居群核型不對稱系數以及隨體類型呈現出由西向東增強趨勢，匍莖百合可能的擴散方式如圖1所示。

箭頭表示匍莖百合可能的擴散方向

3 討 論

周頌東[7]于2008年報道了匍莖百合云南香格里拉納帕草原居群(以下簡稱：納帕草原居群)，核型公式為2n=2x=24=4m+10st(6SAT)+10t，核型不對稱系數為80%，最長染色體/最短染色體比例為1.96，臂比大于2的染色體比例為83%，核型類型為3A型，第3、6和9對染色體都具有隨體。本研究采集的8個居群和周頌東報道的納帕草原居群(共9個居群，分布點見圖1)幾乎涵蓋了匍莖百合所有的分布點，能基本反映匍莖百合染色體特性與地理分布之間的聯系。

百合族的核型同源染色體的雜合性主要是由于染色體的結構變異。染色體結構變異包括染色體的不等長易位、缺失，以及染色體非相互易位、臂間或臂內倒位，前者可引起同源染色體長度不等，后者可引起同源染色體長度、類型和次縊痕差異[7]。在本研究中匍莖百合的同源染色體表現出長度不等，配對差，有無次縊痕，或是組成同源染色體的染色體類型不同等結構變異，這些變異現象在百合族植物中都有發現[7]。染色體的結構變異是百合屬種內分化的基礎，外部表現形式為次縊痕。次縊痕的進化趨勢如下：細胞核型中無次縊痕的種類是較原始的，具次縊痕和次縊痕多的種類是進化的；端部隨體較居間隨體原始[7]。匍莖百合的納帕草原居群的第3對、第6對、第9對具有較進化的居間隨體[8]，在隨體的數量和類型上納帕草原居群也符合表2中8個居群呈現出的隨著從西到東的地理分布，隨體數量增加，居間隨體增加。因此從隨體方面，匍莖百合在核型上(即不同居群的隨體染色體不同)染色體表現出自西到東演化的趨勢。

染色體核型不對稱是細胞地理學研究中的重要量化指標[17]，但Paszko[27]認為僅用Stebbins提出的核型不對稱性是很難準確反映染色體的不對稱性。本研究結合核型類型和Arano[25]提出的核型不對稱系數，基于3項原則(百合族核型的演化由3A←3B→3C[7]；染色體核型由對稱性向不對稱性演化[28]；核型不對稱系數值越高，核型越不對稱[25])分析納帕草原居群的染色體的不對稱性。納帕草原居群[8]的核型不對稱系數偏低，但核型為3A型，隨體數量和類型多，因此認為納帕草原居群是較為進化的居群。

此外，從核型的類型來看，匍莖百合的核型類型可以分為兩類，類型1的染色體組成只有m、st和t三種，如察隅縣-茨中村縣-木里縣這一弧線上的4個居群(納帕草原居群、察隅居群、茨中村居群、木里居群)。類型2的染色體組成有m、sm、st和t四種，多了sm染色體，存在于其他的5個居群。類型1的第一對和第二對染色體均為m，第二對染色體的形態并不完全一致，其中一條的染色體著絲粒較另一條更靠近中部，短臂長度有些許差異。而類型2的第二對染色體著絲粒位置較為接近，為近中部著絲粒。Stebbins[24]認為m染色體向sm染色體的進化時，至少要發生染色間不等羅伯遜易位、同一染色體臂間不等倒位或染色體內轉化，這是染色體結構變異的表現。因此類型1的第二對m染色體間短臂染色體可能發生不等羅伯遜易位，進化為類型2的sm染色體，可以推測察隅居群、茨中村居群、納帕草原居群和木里居群這一條線上與從這一條水平線上分別向北和南方向的居群相比，更為原始。綜合次縊痕、核型不對稱系數和染色體組成等數據，揭示了匍莖百合各居群在地理分布上沿著察隅縣-茨中村-香格里拉市-木里縣這一條線從西到東的遷移、擴散的分布過程中，其對應分布的地理居群的核型也呈現出由西向東的不對稱性增強、由相對原始到相對進化的演化趨勢。同時分布于貢山縣至香格里拉市一線的居群在地理分布上還存在緯度上的向北和向南遷移、擴散的分布擴張態勢，其對應分布的地理居群的核型呈現出由貢山縣至香格里拉市一線向北和向南分布的居群核型不對稱性增加、由相對原始至相對進化的演化趨勢(圖1)。

在匍莖百合的9個居群中，只在書松村居群和木里居群中發現B染色體。B染色體的存在有利于個體和居群在極端條件下存活[29]。書松村居群和木里居群的生境是樹林邊緣的峭壁上，與其他居群的松樹林下和草坡相比，環境相對惡劣，并且周圍環境能發現的個體較少，不似其他居群的個體繁多。因此，B染色體雖然不能作為種級和種下等級的劃分依據，但對特殊環境的適應方面具有十分重要的意義，可以為匍莖百合向外擴大生存空間時，克服特殊生境帶來的向外擴張方面的環境因子障礙，這充分表明特產中國青藏高原的匍莖百合是一個正處于高度分化過程中的物種。