基于轉錄組和代謝組分析馬齒莧根莖葉中類黃酮代謝

張少平，邱珊蓮，黃惠明，張 帥，林寶妹，洪佳敏，鄭開斌

(福建省農業科學院 亞熱帶農業研究所，福建漳州 363005)

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)為馬齒莧科一年生草本藥用植物，其廣泛分布于世界各地，尤以熱帶或亞熱帶地區居多[1-2]。在中東、南亞及中歐等地，馬齒莧嫩莖葉常被用于野菜或調料香草食用[3]。馬齒莧被列為藥食同源植物[4-5]，具有清除自由基、預防冠心病以及保肝、抗菌、抗炎等功效，同時具有抗病毒、抗癌活性和減輕多種疾病等作用[6-8]。馬齒莧富含類黃酮、多糖、萜類、生物堿、甾醇、脂肪酸、維生素及礦物質等活性成分[9-10]。類黃酮為馬齒莧的重要功效成分[11]，由于類黃酮所具有的特殊功效，近年來已引起廣泛關注[12-14]。目前，已報道植物中所含類黃酮種類達4 000種，主要分為黃酮(如蘆丁、木犀草素和芹菜素等)、黃酮醇(如山奈酚、楊梅素、槲皮素、檉柳黃素和漆黃素等)、黃烷酮(如柚皮素、柚皮苷、橙皮素和紫杉葉素等)、異黃酮(如染料木苷和大豆苷等)和花青素(如天竺葵素和矢車菊素等)等六大類[15-17]。類黃酮合成代謝途徑主要包括苯丙氨酸代謝途徑、類黃酮合成代謝關鍵反應以及各種花青素的合成與修飾等階段[18]，所涉及的主要合成酶包括查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)、花青素合成酶/無色花色素雙加氧酶(ANS/ LDOX)以及類黃酮3-O-糖基轉移酶(UF3GT)等[19]。

馬齒莧作為藥食同源植物一直廣受關注，關于馬齒莧的人工栽培、相關成分測定、營養保健及藥理功效等相關研究都有較為詳細的研究報道[3]。在馬齒莧類黃酮相關研究方面，目前已報道馬齒莧不同組織中所含的類黃酮有黃酮醇(山奈酚、楊梅素和槲皮素)、黃酮(蘆丁、木犀草素和芹菜素)、異黃酮(染料木黃酮和染料木苷)以及馬齒莧黃酮醇A、馬齒莧黃酮醇B、馬齒莧黃酮醇C和馬齒莧黃酮醇D等[3,11]。然而馬齒莧不同品種或同一品種不同組織中所含類黃酮種類及其含量存在差異[20-21]。此外，目前還未見馬齒莧類黃酮合成代謝途徑中相關合成酶的報道。因此，本研究擬以馬齒莧根、莖和葉為研究對象，利用代謝組結合轉錄組進行分析，通過不同數據庫注釋后再進行類黃酮成分及其合成酶等關鍵詞檢索并進行歸類。同時挑選部分參與類黃酮合成的酶差異表達基因進行熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證分析，為進一步從事馬齒莧類黃酮合成代謝相關分子生物學研究打下良好基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料馬齒莧為福建省閩南地區常見的紅莖、綠葉和白色根部的野生種，前一年秋季采收種子后，于第二年春季播種于福建省農業科學院亞熱帶農業研究所國家閩臺特色作物種質資源圃內，待夏季開花后，采收馬齒莧根、莖和葉各6份，用75%酒精洗凈后分別轉入2.0 mL離心管，于-80 ℃冰箱保存備用。實驗研究時，取保存備用的馬齒莧根、莖和葉各3份通過提取后進行代謝組學分析；另外各3份通過提取后進行轉錄組測序分析及進一步進行相關基因qRT-PCR驗證。

1.2 方 法

1.2.1 代謝組學分析取馬齒莧根、莖和葉3次重復共9個樣本進行代謝組分析。(1)樣品提取：首先，將樣品放入凍干機(Scientz-100 F)中進行真空冷凍干燥；凍干樣品利用研磨儀(MM 400,Retsch)研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末狀；稱取100 mg粉末，溶解于0.6 mL 70% 甲醇提取液中，于4 ℃冰箱過夜，期間渦旋6次，以提高提取率；離心(轉速10 000 g，10 min)后，吸取上清，用微孔濾膜(0.22 μm pore size)過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析。(2)UPLC分析：色譜柱(1.8 μm,2.1×100 mm)A相流動相為超純水(加入0.04%的乙酸)，B相流動相為乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脫梯度中0～10 min為5%～95% B；10～11 min為95% B，11～11.1 min為 95%～5% B，11.1～14 min為5% B。(3)MS/MS條件：電噴霧離子源(ESI)溫度550 ℃，質譜電壓5500 V，簾氣(CUR)30 psi，碰撞誘導電離(CAD)參數設置為高。在三重四級桿(QQQ)中，每個離子對是根據優化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進行掃描檢測[22]。

1.2.2 類黃酮相關成分篩選馬齒莧相關樣品提取后，通過UPLC結合MS/MS分析，基于百邁客科技有限公司所建數據庫MWDB(metware database)，根據二級譜信息進行馬齒莧根、莖和葉各3個樣品中的類黃酮相關成分進行定性和定量分析。

1.2.3 轉錄組測序采用Trizol法提取馬齒莧根、莖和葉3個部位3次重復共9個樣本總RNA，各自取等量混合組成RNA池，通過磁珠富集、mRNA反轉錄形成cDNA、連接測序接頭、文庫構建以及PCR富集樣本后，進行Illumina HiSeqTM 2500平臺轉錄組測序，所獲取的原始數據在剔除人工接頭序列和低質量讀序等過濾后，干凈讀序再進行組裝即獲得馬齒莧根、莖和葉組織中的單基因簇(unigene)庫。進一步進行單基因簇隨機性和飽和度檢驗等測序文庫質量評估，合格的數據再進行表達量(FPKM)分析及采用Blast軟件[23]進行相關數據庫功能注釋分析。

1.2.4 參與類黃酮合成的酶基因篩選所有數據庫獲取馬齒莧根、莖和葉單基因簇相關信息后，再進行參與類黃酮合成的酶(CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、DFR、ANS、 LAR、 ANR、FLS、FSI/FSII、F2H、IFR、HID、UF3GT)相關基因檢索。同時，根據相關單基因簇FPKM值，進行熱圖分析。

1.2.5 差異表達基因qRT-PCR分析根據轉錄組測序結果中FPKM值，選取在馬齒莧根、莖和葉中差異表達的6個參與類黃酮合成的酶基因進行qRT-PCR檢測。取每個樣品總RNA各500 ng(轉錄組測序過程中所保存RNA)，采用超微量核酸蛋白測定儀(scandrop100)檢測RNA的OD值，使用A260/A280比值判定RNA純度。合格的RNA采用Aidlab公司反轉錄試劑盒(TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit)進行反轉錄操作，采用20 μL體積，根據反轉錄試劑盒中反應體系和反應條件合成cDNA，同時進行6個參與類黃酮合成的酶基因引物合成(表1)，通過程序及體系構建以進行qRT-PCR反應。

表1 熒光定量PCR分析的7個基因及所合成的引物

2 結果與分析

2.1 代謝組分析馬齒莧相關成分

選取馬齒莧根、莖和葉3組，設3個生物學重復共9個樣品，進行代謝組分析。基于UPLC-MS/MS檢測平臺和百邁客科技有限公司所建數據庫，共檢測到401個代謝物。其中類黃酮、脂類、酚酸、氨基酸及其衍生物、生物堿、有機酸等次生代謝產物所含的化合物種類較多，分別有32種、69種、63種、59種、43種和36種；類黃酮在莖部含量高于葉和根部，而脂類、酚酸、生物堿等成分在莖部含量低于葉和根部(表2)。

表2 馬齒莧根、莖和葉片中代謝產物具體成分、數量及含量的平均值

2.2 類黃酮相關成分分析

根據代謝組所獲取的代謝產物，進一步進行類黃酮相關成分分析。結果表明，馬齒莧根、莖和葉中皆含有類黃酮中異黃酮、黃酮醇、黃酮、黃烷酮、黃烷醇和花青素等6類二級代謝產物，這6類二級代謝產物所含化合物分別有3種、8種、11種、3種、5種和2種(表3)。

表3 馬齒莧中類黃酮成分

進一步進行這32種化合物在馬齒莧根、莖和葉(各3個重復)共9個樣品中的相對含量分析表明，馬齒莧類黃酮化合物在莖和葉的總體含量較根部更接近。此外，黃酮(pmb0678)等20種類黃酮化合物在馬齒莧根、莖和葉部含量接近，其中黃酮(pmb0678)、花青素(pme1398)和異黃酮(mws0089)等類黃酮化合物總體含量較低，黃酮(p6273 和pmb0736)和黃酮醇(pmn001642)等類黃酮化合物總體含量較高；而黃烷酮(mws0024)等12種類黃酮化合物在馬齒莧根、莖或葉中含量差異明顯，除黃酮(mws1608)和黃烷酮(N5362)在馬齒莧根部含量相對較高外，其他10個類黃酮化合物在馬齒莧根部含量均很低。此外，異黃酮(pmp000550)和黃烷醇(pmb2979) 等類黃酮化合物在莖和葉部總體含量較高，并以異黃酮(pme1587)和黃酮(pmn001668)等類黃酮化合物在葉部含量最高。

2.3 轉錄組測序結果

進行馬齒莧轉錄組測序，共獲得58.89 Gb的干凈數據，所有根、莖、葉3組和3個生物學重復共9個樣本的數據均高于5.99 Gb。測序堿基Q30大于93.25%。干凈數據經組裝后共獲得57 485條單基因簇，其中單基因簇長度大于1 kb的有18 358條。

所有單基因簇經8個數據庫比對(表4)，共有24 821條注釋到了相關信息，其中注釋到信息的單基因簇長度大1 000 bp的有15 220。此外，在所有數據庫中，NR注釋到單基因簇相關信息最多，達24 579條，其中300～1 000 bp的有9 395條，大于1 000 bp的有15 184條。

表4 不同數據庫所注釋到相關單基因簇數量

2.4 參與類黃酮合成的酶基因分析

所注釋到信息的24 821條單基因簇中，進一步進行類黃酮合成相關酶基因檢索，獲得11種共93條類黃酮相關信息(表5)，其中基因家族數量較多的有UF3GT、F3′H、CHS和IFS，分別有22條、21條、20條和11條；基因家族數量較少的有LAR，只有1條，其他較少的有ANS、F3′5′H、DFR和ANR，各具有2條。

表5 馬齒莧中類黃酮主要合成酶基因

進一步進行該93條類黃酮單基因簇在馬齒莧根、莖和葉(各3個重復)共9個樣品中的相對表達量熱圖分析表明(圖1)：參與馬齒莧類黃酮合成酶基因在莖和葉的總體表達量較根部更接近。此外，大多數參與類黃酮合成的酶基因在馬齒莧根、莖和葉部的表達量接近，只有少量基因的表達量存在較大差異，如編碼為c68208.0和c36394.0等基因簇在根部的表達量顯著低于莖和葉；編碼為c50150.0的基因簇在葉部的表達量顯著高于莖和根。同時，一些單基因簇如c66990.1、c81701.0和c50458.0等在重復的根或莖部位表達量存在較大差異，因此，在取相關數據進行參考時，應盡量選取同一部位3個重復樣品中其中較為一致的2個數據進行參考，這樣更接近真實數值。

圖1 類黃酮主要合成酶在馬齒莧根、莖和葉片中的相對表達量Fig.1 The relative expression in root,stem and leaf of P. oleracea

2.5 差異表達基因qRT-PCR分析

挑選在馬齒莧根、莖和葉轉錄組測序中FPKM值差異表達的6個參與類黃酮合成的酶(表6)，進行qRT-PCR實驗。結果表明，上述6個參與類黃酮合成的酶基因在馬齒莧根、莖和葉中的上下調表達趨勢與轉錄組FPKM值結果一致。其中，F3H (C71132.1)、F3′H(c 73076.0)和IFS (C72466.0)在根部表達量最高；CHS(C65410.1)和CHI (C72950.0)在莖中的表達量最高；UF3GT(C67021.1)在根部表達量較低，在莖和葉中表達更高(圖2)。

圖2 6個差異表達基因在馬齒莧根、莖和葉片中的表達量趨勢Fig.2 The expression trend of 6 differential genes in root,stem and leaf of P. oleracea

表6 熒光定量PCR分析馬齒莧根、莖和葉片中6個差異表達基因

3 討 論

類黃酮為植物次生代謝產物中重要的化合物，關于類黃酮成分及其合成代謝酶基因一直是研究的熱點。在類黃酮相關成分研究方面，目前已報道植物中所含類黃酮種類達4 000種[17]，其中馬齒莧中所含類黃酮有12種[3,11]。而本研究通過高效液相色譜結合質譜進行馬齒莧類黃酮相關成分分析，共獲取馬齒莧中6大類32種類黃酮化合物，同時，進一步明確指出己糖基芹菜素阿魏酰己糖苷、麥黃素7-O-己糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖醛酸苷等 20種類黃酮化合物在馬齒莧根、莖和葉部含量接近；而另外12種在根、莖和葉等不同部位含量差異明顯的類黃酮化合物中，毛蕊異黃酮苷和橙皮素鄰丙酰己糖苷等類黃酮化合物在莖和葉部總體含量較高，大豆苷元-7-O-葡萄糖醛酸苷和芹黃素-3-O-α-L-鼠李糖甙等類黃酮化合物在葉部含量最高。因此，相較于已報道關于馬齒莧類黃酮相關文獻[3,11]，本研究極大地豐富了馬齒莧類黃酮相關化合物成分，為進一步進行馬齒莧不同部位類黃酮相關成分提取利用等打下了良好基礎。

由于目前還未見馬齒莧類黃酮合成代謝相關酶基因的具體分析，因此，本研究通過轉錄組測序，獲得單基因簇信息后，根據已報道其他植物中類黃酮合成代謝所涉及的相關合成酶，進一步進行馬齒莧中相關基因檢索，獲得11類共93條類黃酮相關合成酶單基因簇信息。同時，根據相關單基因簇的FPKM值，進行基因熱圖分析，獲得在馬齒莧根、莖和葉差異表達明顯參與類黃酮合成的酶基因。因此，本研究不僅豐富了馬齒莧類黃酮合成代謝相關酶基因信息，同時為進一步進行馬齒莧參與類黃酮合成酶基因的克隆及轉基因利用等打下良好基礎。

同時，在類黃酮化合物含量及參與類黃酮合成的酶表達量共2個熱圖分析方面：馬齒莧類黃酮化合物在莖和葉的總體含量較根部更接近，其參與類黃酮合成的酶基因相對表達量同樣也是莖和葉較根部更接近。此外，所有類黃酮化合物含量在重復試驗的根、莖或葉部存在差異不明顯，屬于正常誤差范圍，所以數據處理相對簡單；而大多數參與類黃酮合成的酶基因在馬齒莧根、莖或葉部重復試驗中的表達量接近，但UF3GT(C62969.0和C58863.0)、 F3′H(C65171.0)和 LAR等少量基因表達量在不同部位重復試驗中存在較大差異，這主要是因為部分基因表達量極低或有些基因非常敏感，所以在樣品采集、RNA提取及反轉錄等進行轉錄組測序前期過程中導致產生誤差。因此，對相關數據進行參考時，應選取重復樣品中其中較為一致的2個數據，這樣更接近真實數值。

本研究選取6個參與類黃酮合成的酶基因進行qRT-PCR實驗，該結果在馬齒莧根、莖和葉中的上下調表達趨勢與轉錄組FPKM值結果一致，因此，該結果進一步證明了轉錄組測序結果真實可靠。