繡球?qū)?Hydrangea L.)植物分子系統(tǒng)學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育分析

張 梅，楊加文，龍成昌，周 艷，王 永

(貴州省植物園，貴陽550004)

隨著DNA測序技術(shù)等各項分子生物學(xué)研究手段的不斷完善與成熟，利用葉綠體基因組序列與核基因組序列信息構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系目前已經(jīng)成為植物系統(tǒng)學(xué)研究的熱點和主要手段，它向我們揭示了許多以往傳統(tǒng)方法無法發(fā)現(xiàn)和難以解決的問題。目前，利用分子系統(tǒng)學(xué)手段來得到更自然的系統(tǒng)演化關(guān)系已成為有效且普遍的途徑[1-3]，隨著測序技術(shù)的進(jìn)步和系統(tǒng)演化算法的發(fā)展，越來越多的植物類群在分子水平上陸續(xù)開展了工作，利用核基因和葉綠體DNA片段序列進(jìn)行植物類群的分子系統(tǒng)學(xué)研究，能夠更加客觀地顯示其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

核基因組ITS序列(5.8S rDNA和28S rDNA 基因間隔序列，也稱為內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，即Internal Transcribed Spacer，簡稱ITS)已成為植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的DNA片段之一。一方面由于ITS在核基因組中的高度重復(fù)性，同時這些重復(fù)單位已發(fā)生了質(zhì)同進(jìn)化(concerted evolution)[4]；另一方面由于其引物是通用引物，這些特性為測序工作提供了極大的方便。已有資料表明被子植物ITS長度通常為565～700 bp變異幅度很窄，并且無一例外地小于700 bp[5]。ITS序列大小只需用擴(kuò)增時的1對引物即可進(jìn)行全序列測定，使該序列在探討被子植物屬下水平的系統(tǒng)分類與進(jìn)化的研究中得到廣泛應(yīng)用[6-10]。ITS序列表現(xiàn)的變異水平比較適合于屬間、屬下和種間等分類單元的系統(tǒng)學(xué)研究，或有時也用于科、亞科、族內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育研究[6,11-21]。葉綠體基因組(cpDNA)為閉環(huán)結(jié)構(gòu)，其編碼區(qū)和非編碼區(qū)的進(jìn)化速率相差較大，適于不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究：編碼區(qū)的核苷酸代替速率相對較低，如rbcL，matK，ndhF和atpB等，因在大多數(shù)被子植物中為母系遺傳，且進(jìn)化速率較慢，被應(yīng)用在較高分類階元的分子系統(tǒng)學(xué)研究中。而非編碼區(qū)trnL-F片段則適用于較低分類階元種即近緣種的系統(tǒng)關(guān)系研究[5,7,22-24]。

基于分子證據(jù)對繡球花科、繡球花族、繡球?qū)俚南到y(tǒng)發(fā)育研究目前也逐漸展開。繡球?qū)匐`屬于繡球花科，該科共有3個族，分別是黃山梅族(Kirengeshomeae)、山梅花族(Philadelpheae)、繡球花族(Hydrnageeae)；該屬主要在繡球花族內(nèi)，本族除了繡球?qū)偻膺€有其余的8個屬，分別是赤壁木屬(Decumaria)、冠蓋藤屬(Pileostegia)、Broussaisia、常山屬(Dichroa)、草繡球?qū)?Cardiandra)、蛛網(wǎng)萼屬(Platycrater)、鉆地風(fēng)屬(Schizophragma)和叉葉藍(lán)屬(Deinanthe)。很多研究者的研究表明繡球?qū)俨皇且粋€嚴(yán)格意義上的自然類群，從分子系統(tǒng)樹中，外圍的幾個小屬已插入該屬中，如葛麗萍[25]對繡球族的系統(tǒng)學(xué)研究，進(jìn)一步驗證了該屬非單系類群；Samain 等[26]基于葉綠體數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)了該屬為并系類群，繡球花科中的其他屬，如常山屬、冠蓋藤屬、草繡球?qū)佟@地風(fēng)屬均鑲?cè)朐搶僦小５芯恐形覀円舶l(fā)現(xiàn)有些物種的系統(tǒng)位置與前人的研究[27]存在明顯不同，故在該屬植物的系統(tǒng)學(xué)研究中物種鑒定仍然是一個值得關(guān)注的問題。

雖然前人在繡球?qū)俚钠鹪囱莼矫孀隽撕芏喙ぷ鳎苍诓煌潭壬辖鉀Q了很多問題，但對于種類繁多、形態(tài)變異復(fù)雜的繡球?qū)賮碚f，仍然有很多工作有待開展。此外，以上研究雖然在一定程度上解決了繡球?qū)俚钠鹪磁c演化關(guān)系，但由于取樣密度小，代表性不夠，地區(qū)性工作開展少，屬內(nèi)不少類群的演化關(guān)系不清楚，比如繡球?qū)俑黝惾褐g的起源演化關(guān)系。因此，要更好地探討繡球?qū)俚南到y(tǒng)演化關(guān)系還有很多工作需要去做。我們希望通過代表性的取樣，采用合適的DNA序列變異來闡明繡球?qū)俚南到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料的選取

選取繡球?qū)僦参?1個種進(jìn)行分析。實驗所用的材料主要采自野外和PE的標(biāo)本。憑證除特殊標(biāo)注外，所有的憑證均存于中國科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館(PE)。

所有的鑒定標(biāo)準(zhǔn)都是按照原始文獻(xiàn)、模式標(biāo)本及照片和已發(fā)表的《中國植物志》《Flora of China》描述來處理[28-30]。本研究選取葉綠體基因rbcL、atpB、trnL-F及核糖體核基因ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對所得序列使用貝葉斯法(BI)和最大簡約法(MP)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(簡稱BI樹和MP樹)。根據(jù)文獻(xiàn)資料，在確定性狀和性狀狀態(tài)是祖征還是衍征時，經(jīng)常所采用的最重要的(甚至是唯一的)方法是外類群比較[31]。由于山梅花族和繡球族位置很近，在形態(tài)和整個分類系統(tǒng)學(xué)以及前人[25]的研究中發(fā)現(xiàn)繡球花族為一個單系類群，而山梅花族與繡球花族是姐妹類群，因此本研究選取山梅花族的物種(Philadelphus和Deutziae)作為外類群(outgroup)，其外類群的基因片段從Genbank上下載。詳細(xì)的材料信息見表1。

表1 材料來源

續(xù)表1 Continued Table 1

1.2 DNA的提取方法

硅膠干燥的新鮮葉片提取方法使用天根(Tiangen)生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)DP305-02試劑盒提取。

標(biāo)本材料DNA的提取使用CTAB法[32]。

1.3 序列擴(kuò)增和測序

DNA序列擴(kuò)增通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR(Polymerase Chain Reaction)，在Applied Biosystem 9902PCR儀上完成。擴(kuò)增引物見表2(Table 2)。

表2 擴(kuò)增和測序所用引物

1.3.1 PCR反應(yīng)體系25 μL體系，其中總DNA 2 μL，2×Taq PCR Master Mix(北京博邁德生物科技有限公司生產(chǎn))12.5 μL，正反向引物各2 μL，ddH2O 6.5 μL。

1.3.2 擴(kuò)增程序(1)ITS擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸2.5 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

(2)atpB擴(kuò)增程序：92 ℃預(yù)變性3 min，92 ℃變性1 min，57.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸2.5 min，31個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

(3)trnL-F擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，49 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

(4)rbcL擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.3.3 測序?qū)CR產(chǎn)物在1%瓊脂糖上電泳檢測，條帶清晰且沒有拖尾現(xiàn)象的送至華大基因和美吉生物進(jìn)行測序，測序引物和PCR擴(kuò)增引物一致。

1.4 序列分析及系統(tǒng)樹的構(gòu)建

測序結(jié)果用Contig Express軟件進(jìn)行拼接，序列排列用Clustal X v.1.83軟件完成，再用BioEdit v.7.0軟件手工校對(或者直接用BioEdit自動比對，再手工校對)，刪除矩陣兩端缺失部分和內(nèi)部無法準(zhǔn)確比對的區(qū)域(poly結(jié)構(gòu))。用Modeltest ver.3.06軟件確定序列進(jìn)化最適模型，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系采用最大簡約法(Maximum Parsimony，MP)和貝葉斯分析法(Bayesian Inference，BI)進(jìn)行重建。MP分析利用PAUP v.4.0b10軟件完成，BI分析用MrBayes 3b4軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 核基因 (ITS) 的數(shù)據(jù)

用于建立核基因的矩陣共61個種(包括變種和亞種)，一些種類有少數(shù)的插入或缺失的位點，矩陣序列長度為739 bp，則保守位點(Mark Conserved sites)為113個，變異位點(Mark Variable sites)為596個，信息位點(Mark Parsim-infomative sites)為266個。運用貝葉斯法算得的BI樹見圖1，從貝葉斯樹來看，大體可以分為5個進(jìn)化支：Clade1、Clade2、Clade3、Clade4和Clade5，從每個支的最大簡約法的自展支持率(Bootstrap，BP值)和貝葉斯分析法的先驗概率(Posterior probabilities，PP值)值來看，支持率都很低，但每個支內(nèi)的小分支支持率基本都達(dá)到95%以上(圖1)。

圖1 基于核基因的貝葉斯樹Fig.1 Bayesian consensus phylogram based on the branch length of the complete ITS dataset

2.2 葉綠體(rbcL,trnL-F,atpB)的數(shù)據(jù)

用于建立葉綠體基因rbcL的樣品共51個種(包括變種和亞種)，一些種類有少數(shù)的插入或缺失的位點，矩陣序列長度為1 528 bp，則保守位點為1 040個，變異位點為227個，信息位點為103個。用于建立葉綠體基因trnL-F的樣品共55個種(包括變種和亞種)，一些種類有少數(shù)的插入或缺失的位點，矩陣序列長度為1 178 bp，則保守位點為592個，變異位點為412個，信息位點為187個。用于建立葉綠體基因atpB的樣品共43個種(包括變種和亞種)，一些種類有少數(shù)的插入或缺失的位點，矩陣序列長度為1 439 bp，則保守位點為1 098個，變異位點為289個，信息位點為104個。

葉綠體基因rbcL、trnL-F、atpB三個片段連合基因長度為3 800 bp，其保守位點為3 269個，變異位點為321個，信息位點為121個。運用貝葉斯和最大簡約法算得的BI和MP樹見圖2，從樹上看分辨率很低，不能很好地把這個類群分開。從整個系統(tǒng)樹上來看，基部草繡球沒有聚在一起，形成一把梳子的結(jié)構(gòu)，除基部的草繡球以外，其余的物種分為5個進(jìn)化支。Clade1主要的類群為繡球?qū)倮C球組、蛛網(wǎng)萼屬和Broussaisia(PP=0.65)；Clade2主要為繡球?qū)賿炜嘧咏M的物種，但是有離瓣組的西南繡球和臨桂繡球插入其中(PP=1.00,BP=98)；Clade3主要類群為繡球?qū)俚牟糠治锓N和常山(PP=1.0，BP=78)；Clade4主要是赤壁木和冠蓋藤，其支持率較低(PP=0.68)；Clade5主要為草繡球(圖2)。

圖2 基于葉綠體聯(lián)合矩陣的貝葉斯樹Fig.2 Bayesian consensus phylogram based on the branch length of the complete chloroplast dataset

2.3 核基因(ITS)與葉綠體基因(rbcL、trnL-F和atpB)聯(lián)合建樹

ITS、rbcL、trnL-F和atpB四個片段聯(lián)合矩陣長度為4 539 bp，包括3 224個保守位點，1 068個變異位點，293個信息位點。貝葉斯分析所得聯(lián)合數(shù)據(jù)的系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與兩套分子數(shù)據(jù)獨立分析的結(jié)果大體上一致，但有些分支的分辨率和支持率有所提高(圖3)。

圖3 基于核基因和葉綠體基因的貝葉斯樹Fig.3 Bayesian consensus phylogram based on the branch length of the complete ITS+rbcL+trnL_F+atpB dataset

從整個系統(tǒng)發(fā)育樹來看，分為兩個大的進(jìn)化支，8個Group；Clade1具有較低的支持率(PP=0.66)，該支主要有繡球?qū)僦械睦C球組、星毛組和冠蓋組以及蛛網(wǎng)萼屬、鉆地風(fēng)屬、冠蓋藤屬和赤壁木屬的類群，該大進(jìn)化支內(nèi)具有3個小的進(jìn)化支，第1個小進(jìn)化支支持率最高(PP=0.98)，除珠網(wǎng)萼屬以外主要是繡球組的類群；第2個小組進(jìn)化支支持率較低(PP=0.84)，主要類群是鉆地風(fēng)屬、繡球?qū)傩敲M、赤壁森木屬以及冠蓋藤屬；第3個小進(jìn)化支只有繡球?qū)俟谏w組的冠蓋繡球；Clade2的支持率也不高(PP=0.56，BP=96)，該支主要有繡球?qū)匐x瓣組和掛苦子組、常山屬、草繡球?qū)僖约安嫒~藍(lán)屬的類群，該大支具有4個小支，第1個小的進(jìn)化支在整個Clade2中支持率最低(PP=0.98，BP=73)，該小支的類群有繡球?qū)匐x瓣組、常山屬的類群；第2個小的進(jìn)化支支持率相對較高(PP=1.00，BP=96)，該支主要有繡球?qū)賿炜嘧咏M的類群，但有離瓣組的西南繡球插進(jìn)該支內(nèi)；第3個小的進(jìn)化支支持率最高(PP=1.00，BP=100)，主要類群是草繡球?qū)俸筒嫒~藍(lán)屬，這兩個屬互為姐妹類群，且支持率達(dá)100%；最后一個小支主要為喬木繡球(H. arborescens)，該類群主要分布在北美，且支持率很高(PP=1.00，BP=96)。

3 討 論

3.1 繡球?qū)俚南到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系

從核基因ITS序列，葉綠體基因rbcL、trnL-F、atpB序列以及核基因和葉綠體基因聯(lián)合建成的樹來看，繡球?qū)俨皇且粋€嚴(yán)格意義上的自然類群，與前人[3,17,33-35]的研究成果相一致。在整個系統(tǒng)樹上可以看出，喬木繡球(H.arborescens)先分化出來，再到草繡球?qū)俸筒嫒~藍(lán)屬，這個結(jié)果與葛麗萍[25]和Samain等[26]的結(jié)果有沖突，他們的結(jié)果顯示，草繡球?qū)俸筒嫒~藍(lán)屬最先分出。

從整個分支系統(tǒng)來看，可分為兩大支，叉葉藍(lán)、草繡球、繡球?qū)僦械膾炜嘧咏M、Broussaisia、常山屬以及繡球?qū)僦械碾x瓣組為基部類群；而繡球?qū)僦泄谏w組、赤壁木屬、冠蓋藤屬、鉆地風(fēng)屬、蛛網(wǎng)萼屬、繡球?qū)僖约袄C球?qū)僦欣C球組為進(jìn)化的類群。總體來看可分為8個Group，Group 1主要為繡球?qū)僦欣C球組的類群，這個結(jié)果與Jacobs[27]的結(jié)果一致，該Group的關(guān)鍵特征是子房完全下位，蒴果頂端截平；Group 2為蛛網(wǎng)萼屬和北美的H.involucrata、H.sikokiana；Group 3主要是鉆地風(fēng)屬、冠蓋藤屬和赤壁木屬，該Group與Hufford 等[33]的Schizophragmaclade一致；而繡球?qū)僦械墓谏w組單獨成一支為Group 4；Group 5為繡球?qū)僦械碾x瓣組、常山屬和Broussaisia，該支與Samain 等[26]的研究結(jié)果一致，該Group的性狀為子房上位，蒴果頂端突出的部分非圓錐形；Group 6主要為掛苦子組的類群，其中離瓣組的西南繡球與掛苦子組的東陵繡球形成了姐妹群，且支持率達(dá)到100%，但無論在宏觀形態(tài)上或是種子微形態(tài)、孢粉形態(tài)上這兩個種都有很大的出入，導(dǎo)致這種情況的原因可能是在序列數(shù)據(jù)處理時，我們發(fā)現(xiàn)繡球?qū)購V泛出現(xiàn)套峰結(jié)構(gòu)，我們對這種情況的處理方法是將其標(biāo)記為簡并堿基，因此導(dǎo)致大量的信息位點消失，從而導(dǎo)致以上的這種情況；Group 7主要為草繡球?qū)俸筒嫒~藍(lán)屬，支持率都為100%，他們互為姐妹類群與trnL-F序列[25]、matK序列[33]和rbcL序列[3]建立的系統(tǒng)樹一致支持這個結(jié)果，說明這兩個屬在系統(tǒng)上形成兩個姐妹群是毋庸置疑的，他們的最大特征是均為草本，多數(shù)的雌蕊、雄蕊發(fā)生時形成對萼三聯(lián)體、覆瓦狀的花冠卷疊式等。Group 8為北美的種喬木繡球，該種為林奈于1753年最早提出的。

3.2 繡球?qū)賰?nèi)物種間的關(guān)系

馬桑繡球(H.aspera)和柔毛繡球(H.villosa)在形態(tài)上極為相似，其葉、葉柄、小枝及花序毛被為單毛，葉下面密被顆粒狀腺體，而馬桑繡球葉下面密被灰白色、直或稍彎曲、彼此略交結(jié)的短柔毛，脈上的毛稍長，花柱多數(shù)3，少有2；柔毛繡球傘房狀聚傘花序分枝密集，緊靠，彼此間隔短，一般長5～20 mm，有時也有個別較長的，葉下面密被灰白色短絨毛，脈上的毛較長，常帶黃褐色，小枝和總花梗較粗，常具鈍棱，密被灰白色或黃褐色短柔毛和粗長毛；從形態(tài)性狀上來看這兩個種沒有太大區(qū)別；分布上，兩者均分布在云南、四川、貴州以及廣西，而柔毛繡球還分布在甘肅、陜西、江蘇、湖北、湖南等地，相對馬桑繡球來說，分布較廣且在馬桑繡球分布區(qū)的外圍，因此柔毛繡球應(yīng)為馬桑繡球的輻射類群。

根據(jù)核基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，柔毛繡球、馬桑繡球、紫彩繡球聚為一支，且PP值和BP值都達(dá)到最高值，但在形態(tài)上，紫彩繡球與其兩個種的差異甚遠(yuǎn)；根據(jù)葉綠體基因和核基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，其2個種聚在一起，與紫彩繡球互為姐妹類群，且支持率達(dá)最高值；在野外對其二者的識別度極低，最大的區(qū)別是柔毛繡球的葉是披針形和卵披針形，而馬桑繡球為長卵形、卵披針形或長橢圓形；但從生物地理學(xué)以及居群的水平可以發(fā)現(xiàn)兩者葉形只是一個漸變的過程，且種子、花粉形狀及表面紋飾均屬于同一種類型[35-36]，因此本研究的數(shù)據(jù)結(jié)果均支持此二者應(yīng)為一個類群，則支持最新版FOC中將柔毛繡球作為馬桑繡球的異名并入該種的處理結(jié)果。

3.3 形態(tài)性狀的演化趨勢

繡球?qū)俚姆诸愋誀钪饕獮樽臃俊⑤艄⒒ㄐ颉⒖捎ㄅc不育花、種子微形態(tài)、葉表皮、孢粉等，因此探討這些性狀對繡球?qū)俚姆诸愋抻喓拖到y(tǒng)演化關(guān)系具有很重要的意義。

關(guān)于蒴果的類型，從整個系統(tǒng)發(fā)育樹上來看(圖4、圖5)，我們發(fā)現(xiàn)掛苦子組在樹的基部，其蒴果為頂端突出，而到中部的常山屬和離瓣組，蒴果頂端突出的部分只有1/3～1/2，再到最頂端的繡球組，蒴果頂端截平；則說明蒴果頂端截平和子房完全下位是較為進(jìn)化的類群。

圖4 核基因和葉綠體基因的BI樹與葉片形態(tài)相關(guān)性Fig.4 Correlation analysis of BI tree of ITS and chloroplast genes with leaf morphology

圖5 核基因和葉綠體基因的BI樹與種子形態(tài)和孢粉學(xué)的相關(guān)性Fig.5 Correlation analysis of BI tree of ITS and chloroplast genes with seed morphology and palynology

花序、花在整個系統(tǒng)樹上看不出任何的變化規(guī)律以及演化趨勢，而花粉自身的演化趨勢在本次研究中體現(xiàn)得并不明顯，在系統(tǒng)樹的基部、中部和頂端均未發(fā)現(xiàn)具有同一類型花粉的物種集中出現(xiàn)的現(xiàn)象(圖5)。但在部分小屬中體現(xiàn)出了相應(yīng)的規(guī)律性，如赤壁木、冠蓋藤的花粉為長球體形，而鉆地風(fēng)、常山、蛛網(wǎng)萼的花粉形狀為近球體形，從系統(tǒng)樹上看，赤壁木、冠蓋藤較鉆地風(fēng)、常山、蛛網(wǎng)萼進(jìn)化，則花粉長球體形比近球體形進(jìn)化，這個結(jié)論與前人[37-39]的理論一致：花粉的進(jìn)化趨勢是花粉粒相對體積的縮小過程，即由大到小的進(jìn)化。

種子演化趨勢在系統(tǒng)樹上可以看出部分規(guī)律(圖5)，如基部為掛苦子組的類群，其種子的形狀為長柱形，其種子表面具平直狀的脊，脊間較光滑，種子翅的類型為兩端具翅；而中部為離瓣組的類群，其種子形狀為橢圓體形、網(wǎng)脊為波狀或深波狀、脊間有不規(guī)則或規(guī)則或孔穴的次級紋飾，多數(shù)為不規(guī)則紋飾，少部分為規(guī)則或孔穴紋飾，種子的翅為一端或兩端具翅；中上部的冠蓋組種子為長柱形或橢球形，表面具網(wǎng)狀多邊形紋飾，網(wǎng)眼內(nèi)具洼點，具周翅；最頂端的繡球組種子均為橢球形、網(wǎng)脊近平直，脊間較光滑，兩端具翅；從整個演化過程來看種子的橢球形較長柱形進(jìn)化，網(wǎng)脊平直較網(wǎng)脊彎曲進(jìn)化。

葉表皮微形態(tài)在本研究中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的變化規(guī)律，可能的原因是葉表皮受到環(huán)境因素的影響較大，性狀較不穩(wěn)定(圖4)；但在某些小支上也表現(xiàn)出相應(yīng)的一致性，比如Clade 1的最頂支，其葉的形態(tài)為橢圓披針形，表皮毛被較多，且毛被表面不光滑。