羌活與寬葉羌活的群體遺傳結構和種間分化研究

灑 威，周 通，關天霞，尚千涵，尹 衛，田 鳳，李忠虎*

(1 青海大學 生態環境工程學院，省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，西寧 810016；2 西北大學 生命科學學院，西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室，西安 710069；3 青海省科學技術信息研究所有限公司，西寧 810001)

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，一般指種內遺傳多樣性，或稱遺傳變異，是生物體內遺傳物質發生改變，并能穩定遺傳的一種變異，正是由于這種變異存在使得生物體在不同水平上具有多樣性[1-2]。影響物種遺傳多樣性的因素，包括物種的繁育系統、自然選擇、基因流，以及由于環境變化和人為因素干擾引起的種群隔離、生境破碎化等[3-4]。對物種遺傳多樣性的研究可以揭示物種或種群的進化歷史，預測其進化趨勢和未來命運[5]。

植物通常以種群作為進化的基本單位，衡量其遺傳多樣性除了要考慮種群遺傳變異性的高低，還要探究其遺傳分布模式，即遺傳結構。一般來說，瀕危物種的種群具有片段化分布的特征，生境的異質性與遺傳結構的形成尤為密切，研究物種不同自然地理分布區域的遺傳變異式樣，有助于深入探究物種稀有或瀕危的原因及過程[1]。分子標記技術是研究遺傳變異和遺傳結構的主要手段，其中簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)[6]是以1～6個核苷酸為基本重復單位的一段DNA串聯重復序列，普遍存在于真核生物基因組中。鑒于SSR標記操作簡單、呈共顯性遺傳，并且重復單位的重復次數在個體間高度變異且數量豐富，能揭示更高程度的多態性，近年來已廣泛應用于模式植物如大豆、水稻、玉米等植物遺傳圖譜構建、基因定位及遺傳多樣性等研究領域[7-8]。

羌活(Notopterygiumincisum)與寬葉羌活(Notopterygiumfranchetii)，隸屬于傘形科羌活屬，是中國特有的珍稀瀕危藥用植物[9]，主要生長在四川、云南、西藏、陜西等省的山區，海拔高度范圍在1 700～5 000 m。在自然界，羌活屬植物種子萌發力弱，生長速度緩慢，目前尚無完善的人工馴化種植機制，難以實現規模化栽培。近年來，價格和需求等因素促使人們對野生植物資源掠奪式采挖，如今羌活在最適生長區域已呈瀕危狀態，現有資源分布區域的生態環境極為惡劣，不利于種群更新和繁衍[10]。為了有效保護羌活屬植物的野生資源，了解其瀕危機制，亟需對其遺傳變異組成、遺傳結構和種間分化模式進行研究。但目前國內外對羌活屬植物的研究僅局限于種子萌發[11]、系統分類[12]、化學成分分析[13]、藥理作用、人工育苗技術[14]、群落與環境的關系[15]等方面，從DNA分子水平上對羌活種群的研究相對缺乏，且針對羌活保護生物學的研究還不完善。本研究利用SSR標記對羌活與寬葉羌活鄰域及異域分布的自然種群進行研究，探索物種遺傳多樣性的地理分布和遺傳結構的空間模式，揭示兩物種間基因交流的大小以及物種分化程度，為兩種珍稀植物資源的合理利用和科學保護提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料采集

本研究于陜西、甘肅、青海和四川4個省份，選擇羌活與寬葉羌活共23個種群的227個個體作為研究對象，其中羌活13個種群132個個體，寬葉羌活10個種群95個個體。將采集的新鮮嫩葉存放于自封袋中，用硅膠干燥，室溫保存，同時詳細記錄每個采樣地點的海拔和經緯度等信息(表1，圖1)。

藍色圓圈代表寬葉羌活，黃色圓圈代表羌活

表1 羌活和寬葉羌活野外采樣信息表

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取和引物篩選取硅膠干燥的植物葉片，使用改進的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取羌活和寬葉羌活的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，觀察并拍照記錄電泳結果。利用30對多態性較高的SSR引物對檢測合格的DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)，經過溫度梯度和多態性篩選能夠在羌活和寬葉羌活中成功擴增并具有多態性的特異性引物(表2)。

表2 微衛星引物信息表

1.2.2 PCR擴增及其產物檢測本研究選擇了12對多態性的微衛星標記引物，對羌活和寬葉羌活的所有采樣個體進行PCR擴增。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min，然后進行36次循環： 94 ℃變性30 s，54～58 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min；最后72℃延伸7 min，10 ℃保存。PCR反應體系為：10 μL反應溶液中包含Mix 5 μL、雙蒸餾水3.4 μL、模板DNA 1 μL、上游引物和下游引物各0.3 μL。PCR擴增產物放置于4 ℃冰箱儲存。隨后用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增目的條帶，用1%硝酸銀溶液進行染色，再用氫氧化鈉溶液和甲醛溶液顯影，放入成像儀中觀察并拍照記錄試驗結果。最后對所有引物進行熒光標記，重新對所有取樣個體進行PCR實驗，然后對擴增得到的PCR產物利用毛細管電泳的方法進行基因分型分析。

1.3 數據分析

使用Genemaker軟件讀取每個SSR標記主峰的分子量大小，記錄分析所得數據。同時利用Genemaker軟件統計群體遺傳多樣性參數，包括等位基因數目(Na和Ne)、基因雜合度(Ho和He)和多態性信息含量(I)等，以及可以反映群體遺傳分化程度的參數，包括近交系數(Fis)和基因流(Nm)等。Arlequin軟件進行分子方差分析(AMOVA)用于統計遺傳變異情況，同時計算物種間和群體間遺傳分化系數(Fst)。此外，基于Structure軟件分析確定樣本的聚類分組，分析種群遺傳結構；同時使用GenAlx軟件進行主坐標分析(principal component analysis,PCoA)研究各個種群間的遺傳相似性和遺傳關系。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性

12對SSR引物檢測23個種群227個樣本的遺傳多樣性參數計算結果見表3和表4。在羌活群體中，檢測到平均等位基因數目(Na)和有效等位基因數(Ne)的變化范圍分別為2.000～3.333和1.369～2.324，平均值分別為2.603和1.777；期望雜合度(He)在0.198～0.472之間，平均值為0.313；觀測雜合度(Ho)在0.145～0.420之間，平均值為0.308；多態性信息指數(I)在0.358～0.864之間，平均值為0.566。在寬葉羌活群體中，檢測到Na和Ne的變化范圍分別為2.000～2.583和1.524～1.857，平均值分別為2.200和1.641；He在0.222～0.366之間，平均值為0.308；Ho在0.242～0.400之間，平均值為0.320；多態性信息指數在0.385～0.611之間，平均值為0.508。以上遺傳學參數說明2個物種具有中等水平的遺傳多樣性，各自種群間等位基因數目差異不大，但羌活種群的雜合度變化范圍較大，種群間的雜合子數目差異明顯(圖2)。

M表示DNA分子量標準；1～30代表不同的取樣個體

表3 羌活和寬葉羌活23個種群的遺傳多樣性分析

近交系數(Fis)值越接近于零，則基因型分布越接近于平衡狀態，Fis>0說明雜合子缺失，Fis<0說明雜合子過剩[16]。羌活與寬葉羌活群體近交系數(Fis)平均值分別為0.034和-0.051，表明羌活和寬葉羌活群體整體基因型表現為雜合子過剩，種群內存在較多的雜交和遠交現象。此外，羌活和寬葉羌活的基因流(Nm)分別為1.211和1.118，說明群體間存在一定程度的基因交流。

2.2 遺傳結構分析

基于貝葉斯算法的Structure軟件對所有羌活和寬葉羌活的取樣種群進行遺傳聚類分析，由K的變化范圍和K的似然概率變化曲線可知(圖3，B、C)，所有個體的最佳分組為K=2，即將所有種群分為兩個大組，如圖3，A所示：羌活13個種群分為一個大組(綠色區域)，寬葉羌活10個種群分為另一個大組(紅色區域)。聚類分析將羌活與寬葉羌活的自然種群分開，說明兩個物種在DNA分子水平上出現了明顯分化。然而，在兩個大組之內一些種群(如種群YD、KZ、KO、C、G、H、HF和HH等)存在著基因型的混雜現象，說明兩物種間存在一定程度的基因交流和遺傳漸滲。

A. K=2時Structure分組圖；B. K的變化范圍圖；C. K的似然概率變化圖

分子方差分析(AMOVA)結果顯示(表4)：兩個羌活屬物種種間變異占26.69%，種內群體間變異占15.60%，群體內變異占57.71%，表明羌活與寬葉羌活的遺傳變異主要存在于種群內。在種內水平上，羌活群體間變異和群體內變異分別為18.02%和81.98%，寬葉羌活群體間變異和群體內變異分別為19.14%和80.86%。兩個物種種間遺傳分化系數(Fst)值為0.423，說明兩物種間存在較高水平的分化。在種內水平上，羌活和寬葉羌活各自群體間內也存在著較高水平的遺傳分化(羌活Fst=0.181，寬葉羌活Fst=0.191)。

表4 羌活與寬葉羌活的分子方差分析(AMOVA)

主坐標分析(Principal coordinates analysis，PCoA)的結果可以直觀反映種群間的遺傳相似性和遺傳分化情況。本研究的主坐標分析結果顯示(圖4)，寬葉羌活10個種群親緣關系較近，聚集在一個區域；羌活13個種群親緣關系較近，聚集在另一個區域。羌活和寬葉羌活明顯分為兩個不同的遺傳分組區域，顯示兩個物種間的遺傳差異較大，分化程度高，單個物種在一個區域內的分布程度相對分散，說明群體間出現不同程度的分化，這種分化可能由群體內的遺傳變異引起。

圖4 羌活與寬葉羌活的主坐標(PCoA)分析Fig.4 Principal coordinates analysis of N. incisum and N. franchetii

3 討 論

3.1 遺傳多樣性

Shannon多態性信息指數(I)可以作為衡量生物物種遺傳多樣性的一個指標，其值大小與等位基因數目有關。本研究中，羌活與寬葉羌活自然種群中檢測到的I值分別為0.566和0.508，均大于0.5，因此認為兩個物種自然群體具有較為豐富的遺傳變異。比較其他遺傳多樣性參數發現，羌活的平均等位基因數(Na=2.603)高于寬葉羌活(Na=2.200)，但羌活種群間的雜合度變化范圍較大，導致其觀測雜合度的平均值(Ho=0.308)略低于寬葉羌活(Ho=0.320)。其中，觀測雜合度(Ho)表示被檢測位點上各群體中雜合子出現的頻率，一般認為是度量群體遺傳變異的一個最適參數，觀測雜合度值越高，反映群體的遺傳一致性就越低，其遺傳多樣性就越豐富[17]。此外，本研究檢測到寬葉羌活群體近交系數(Fis)為負值，說明整體基因型表現為雜合子過剩，群體中存在一定程度的雜交和遠交，而羌活群體近交系數(Fis)接近于零，也說明群體中存在一定的雜合子過剩情況。對于大多數野生植物來說，近交是造成群體雜合度下降的主要原因，這種現象很容易使物種喪失部分基因型，最終導致遺傳多樣性逐漸下降和衰退。據野外調查，目前野生羌活資源成片分布較少見，其零星殘存野生分布區已上溯到海拔3 500 m甚至 4 000 m以上[18]，部分長期隔離的種群更傾向于近交從而導致雜合度下降，因此羌活各個種群雜合度差異較大。此外，本研究檢測到羌活種群遺傳多樣性高于唐學芳等[19]對川產羌活遺傳多樣性的研究結果(I=0.2419,Na=1.4517)，可能與我們選取的羌活植物材料地理分布范圍更大有關。與其他傘形科多年生草本植物相比[20-22]，本研究選取的兩種羌活屬植物具有較高的遺傳多樣性，可能與其較大的自然地理分布范圍和種群長期的進化歷史有關。

3.2 遺傳結構和物種分化

遺傳變異是生物多樣性的核心，在生物多樣性保護中具有重要意義[3]。分子方差分析結果顯示，兩個羌活屬物種的種間變異較小(26.69%)，大部分變異存在于物種內(群體間15.60%，群體內57.71%)。根據基因組成的差異性，采用Structure聚類分析和主坐標(PCoA)分析，得到最佳分組結果為K=2，即將羌活和寬葉羌活的23個自然種群分為2個不同的遺傳分組，分別對應于羌活和寬葉羌活2個物種，說明兩物種間存在較高程度的遺傳分化。采用2種不同的分析方法對群體遺傳變異情況進行探究，雖然它們在結果表現形式上略有不同，但所揭示羌活與寬葉羌活的遺傳分化較為一致，都表明兩個物種間分化程度較高，并且遺傳變異主要源自群體內。陳海鈴等[23]使用這2種方法對瀕危植物金茶花的遺傳結構進行分析也得出類似結論，推測如果野生種群數量小且處于長期孤立狀態，有可能導致同屬近緣物種間高水平的遺傳分化。

一般來說，影響群體遺傳結構的主要因素有繁育系統和基因流模式等，自交類型植物群體間遺傳分化較大，而異交類型植物群體間的分化一般較小[24]。據野生羌活人工引種栽培試驗研究，發現羌活與寬葉羌活在海拔高度上存在部分生態位重疊，但寬葉羌活生態位更寬，更能夠適應較低海拔的環境(2 500～4 000 m)，而羌活更能適應高海拔的環境(3 000～5 000 m)[25]。羌活與寬葉羌活采用異花授粉的方式進行繁殖，本研究檢測到種間遺傳分化系數(Fst)為0.423，說明地理隔離導致兩個物種間基因交流程度低，種間分化較大。進一步比較分析發現，羌活與寬葉羌活各自群體間均具有較高水平的遺傳分化，但羌活群體間的分化程度(Fst= 0.181)低于寬葉羌活(Fst= 0.191)，這可能與過度采挖導致羌活集中分布于高海拔地區有關。由于種群減少和棲息地片段化導致羌活群體間存在一定程度的近交，基因組成趨于一致，所以羌活群體間變異成分較少。Gitzcndanner和Soltis對比分析了片段化分布小種群和廣布近緣物種的遺傳變異情況，發現雖然小種群并不代表遺傳多樣性喪失，但對大多數物種來說，它的確會造成總的遺傳變異降低[26]，這可能是羌活遺傳分化程度低于寬葉羌活的原因。綜上，在瀕危物種保護時，應根據遺傳學分析的結果，對羌活和寬葉羌活各自群體劃分為不同的地理單元進行科學管理和保護。