和田沙漠玫瑰品種系統發育關系初步研究

孫美樂，張 俊，李 巖，藺國倉*

(1 新疆農業科學院 綜合試驗場，烏魯木齊 830012；2 新疆大學 資源與環境科學學院，烏魯木齊 830046)

雜交和多倍化是植物進化的兩個重要過程[1]。薔薇屬物種間雜交障礙很低[2]，種間雜交、基因漸滲以及多倍化極大豐富了薔薇屬的物種多樣性[2-5]，超過一半的物種為多倍體。然而，雜交和多倍化導致薔薇屬物種種間表型特征趨同化，給物種鑒定帶來了困難[6]。

玫瑰(Rosarugosa)原產于亞洲東部地區，在中國東部沿海、日本、朝鮮和俄羅斯遠東地區均有分布。玫瑰能與薔薇屬其他物種進行天然和人工雜交，產生雜交漸滲后代和雜交品種。于18世紀引入歐洲，與歐洲、地中海、中東地區的十余種薔薇屬(Rosa)植物，如月季花(R.chinensis)、大花香水月季(R.odoratavar.gigantea=R.gigantea)、麝香薔薇(R.moschata)、露西亞薔薇(R.luciae)、野薔薇(R.multiflora)、法國薔薇(R.gallica)、重瓣異味薔薇(R.foetida)，發生廣泛雜交產生了目前世界上常見的薔薇屬園藝品種，通常被稱作現代玫瑰或月季品種[7]，如‘法蘭西(La France)’是中國薔薇與歐洲薔薇的雜交品種[8]；紫枝玫瑰(R.rugosa‘ZiZhi’)為平陰玫瑰與山刺玫(R.davurica)的雜交種。

玫瑰是中國的傳統名花及油用植物之一，在長達兩千多年的玫瑰栽培歷史中，出現了許多特色栽培品種，如紫枝玫瑰、豐花玫瑰(R.rugosa‘Fenghua’)、和田沙漠玫瑰(R.rugosa‘Hetianshamomeigui’)。新疆和田是國內四大玫瑰產區(山東、甘肅、云南、新疆)之一，地處中國極端干旱區、塔克拉瑪干沙漠南緣，自然地理環境和水土光熱條件獨特，非常適宜玫瑰生長發育，該地區已有兩千多年的玫瑰栽培歷史。和田沙漠玫瑰以其品質好、豐產性好、抗逆性強，樹體耐鹽堿、耐旱、抗病蟲害特點突出，得到了大力推廣種植，并形成了成熟的種植加工產業鏈。截至2019年，和田沙漠玫瑰栽培面積已達4667 hm2，產量2.8萬t。對于南疆貧困地區增加地方稅收和群眾收入，打贏脫貧攻堅戰具有重要的促進作用。雖然和田沙漠玫瑰在和田地區有著悠久的食用歷史，但不能證明其屬于重瓣紅玫瑰(R.rugosavar.plena，平陰玫瑰)，無法作為普通食品進行生產經營，造成北京、上海、廣州等城市產品下架退貨，從而嚴重制約了和田地區玫瑰加工產業的發展。因此，明確和田沙漠玫瑰與重瓣紅玫瑰品種之間的關系，對于將和田沙漠玫瑰作為普通食品推向市場，促進新疆的玫瑰產業向優質高效、標準化、規范化方向發展具有重要的作用。基于此，本研究利用單拷貝核GAPDH基因和葉綠體(cp)DNAtrnL-F、trnH-psbA序列分析和田沙漠玫瑰與重瓣紅玫瑰品種(豐花玫瑰、紫枝玫瑰)之間的遺傳距離和相似度，確定它們之間的關系以及是否為同一品種，分析和田沙漠玫瑰在薔薇屬內的系統發育關系，探討和田沙漠玫瑰的起源。

1 材料和方法

1.1 材 料

研究材料為和田沙漠玫瑰(Hetian)、豐花玫瑰(Fenghua)、紫枝玫瑰(Zizhi)和大馬士革玫瑰(突厥薔薇R.damascena，Damask)。和田沙漠玫瑰為直立叢生小灌木，高約2 m；小枝密被針刺、腺毛及淡黃色的皮刺，小葉 5～9；葉片橢圓形或橢圓狀倒卵形，邊緣有尖銳鋸齒，上面深綠色，無毛，葉脈下陷，下面灰綠色，密被絨毛和腺毛，中脈有稀疏硬刺；托葉大部貼生于葉柄；花數朵簇生，花梗密被腺毛，花直徑 4～6.5 cm，重瓣至半重瓣，芳香，紫紅色(圖1)，花柱離生，被毛，稍伸出萼筒外，比雄蕊短很多。花梗長約3 cm，表面有稀疏剛毛；果實瓶狀，長約2 cm，直徑1～1.2 cm，果皮成熟時金黃色，陽面有紅暈，表面有稀疏剛毛，萼片脫落。花期5～6月。大馬士革玫瑰是一種主要的油用玫瑰品種，起源于中東(伊朗)一帶，現廣泛分布在地中海沿岸的一些國家和地區，在保加利亞、土耳其、法國等都有栽培，中國也有不少地方引種大馬士革品種。和田沙漠玫瑰精油成分與大馬士革玫瑰精油成分組成較相似。豐花玫瑰和紫枝玫瑰為重瓣紅玫瑰中產量高、品質好、適應性強的2個品種，種源為傳統重瓣紅玫瑰，均收錄于中國食藥名錄中。

圖1 4個玫瑰品種的形態特征Fig.1 The morphological feature of the four rose varieties

本研究所用和田沙漠玫瑰采自和田地區于田縣、墨玉縣，隨機采集10個植株；豐花玫瑰、紫枝玫瑰和大馬士革玫瑰由山東平陰玫瑰研究所提供。每個品種隨機選擇5個個體，從每個植株上采集幼嫩葉片5～10片，硅膠干燥。以上25份葉片樣本用于DNA測序分析。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取取干燥后的葉片0.05 g，液氮研磨后，利用CTAB法[9]提取葉片基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢查基因組DNA的質量，利用微量核酸分析儀(Nanodrop)檢測DNA濃度。

1.2.2 基因擴增和測序利用已發表引物擴增基因片段核GAPDH基因[3]、cpDNApsbA-trnH[10]和trnL-F[11]片段。反應體系25 μL，含DNA 50～100 ng，引物濃度0.1～0.2 μmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，1.5 mmol/L MgCl2， 0.5 U Taq DNA聚合酶。

反應程序：GAPDH：94 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35循環，最后72 ℃延伸10 min。

psbA-trnH：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35循環，最后72 ℃延伸10 min。

trnL-F：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，35循環，最后72 ℃延伸10 min。

擴增產物經電泳檢測和純化后，送至上海生工進行測序。挑選和田沙漠玫瑰6個個體，豐花玫瑰、紫枝玫瑰、大馬士革玫瑰各2個個體進行GAPDH測序；GAPDH利用克隆測序方法完成測序，將GAPDH擴增產物連接到克隆載體上，每個個體挑選10個陽性克隆進行雙向測序。所有25個個體均進行psbA-trnH和trnL-F序列測序，利用擴增引物進行雙向測序。

1.2.3 序列整理和分析對測序原始數據進行整理，剔除測序質量低的堿基，雙向序列利用Sequencer V4.4組裝，組裝后的序列利用ClustalW進行比對。對照原始峰圖文件檢查變異位點，對序列進行校正。

對GAPDH基因，同一個品種的所有克隆序列，逐一對多態性核苷酸位點進行核實，當兩個及兩個以上單克隆某位點的單核苷酸變異相同時，該變異位點視為有效。如果兩個及兩個以上單克隆序列一致時，這些序列被視為一條序列用于后續分析。cpDNApsbA-trnH和trnL-F均獲得較理想的測序結果，將2個片段串聯合并后用于后續分析。

利用核GAPDH克隆基因序列計算和田沙漠玫瑰與其他3個品種玫瑰間的遺傳距離和遺傳相似度，遺傳距離計算由軟件MEGA 7.0完成。從基因數據庫中下載薔薇屬其他物種的GAPDH、psbA-trnH和trnL-F基因片段的數據(表1)，分別對核GAPDH和cpDNA進行系統發育分析，構建最大簡約(MP)系統發育樹和貝葉斯系統發育樹。最大簡約法參數設置：最大簡約搜索方法TBR，gaps/missing位點數據部分刪除，利用自展法(1000次)評估系統發育樹的支持率。利用MEGA 7.0軟件進行MP系統發育分析，并基于BIC標準篩選最優堿基替代模型。利用Beast V1.7軟件包進行貝葉斯系統發育分析，參數設置：堿基替代模型為HKY+G，GAPDH和cpDNA MCMC分別運行800萬次和500萬次，每運算1 000次取1次樣。GAPDH和cpDNA數據各獨立運算2次，運算完成后，利用Tracer V1.5檢測有效樣本量(每個參數的ESS值均大于200)，之后利用LogCombiner V1.7將2次運算的結果合并。舍棄10%老化樹(burnin)，利用剩余的90%樹構建最大可信樹，用后驗概率(PP)值檢驗分支可信度。

表1 本研究所用薔薇屬和外類群物種以及DNA序列的GenBank序列號

2 結果與分析

2.1 測序數據

測序共獲得和田沙漠玫瑰6個體(59個克隆)、豐花玫瑰2個體(19個克隆)、紫枝玫瑰2個體(19個克隆)以及大馬士革玫瑰2個體(19個克隆)，共118個GAPDH克隆序列；和田沙漠玫瑰6個體的59個GAPDH克隆序列長739 bp，其中變異位點有66個，簡約信息位點有28個，平均遺傳距離為0.017。和田沙漠玫瑰10個個體的葉綠體DNA(cpDNA，psbA-trnH+trnL-F)序列完全一致，總長度1 341 bp。紫枝玫瑰、豐花玫瑰和大馬士革玫瑰的cpDNA序列也完全一致，總長度分別為1 390 bp、1 390 bp和1 444 bp，4個品種的cpDNA檢測到24個多態位點和簡約信息位點。

續表1 Continued Table 1

2.2 遺傳距離分析

基于GAPDH序列，和田沙漠玫瑰品種內的遺傳距離為(0.017±0.003)，紫枝玫瑰、豐花玫瑰、大馬士革品種內的遺傳距離分別為(0.009±0.002)、(0.011±0.002)、(0.015±0.003)；和田沙漠玫瑰與豐花玫瑰、紫枝玫瑰、大馬士革玫瑰的品種間遺傳距離分別為(0.029±0.005)、(0.024±0.004)、(0.022±0.003)，均大于品種內遺傳距離。和田沙漠玫瑰與其他3個玫瑰品種間的遺傳相似性分別為0.971、0.976、0.978(表2)。cpDNA數據表明4個品種內的遺傳距離為0；和田沙漠玫瑰與豐花玫瑰、紫枝玫瑰、大馬士革玫瑰的品種間遺傳距離分別為(0.014±0.005)、(0.014±0.004)、(0.008±0.003)。和田沙漠玫瑰品種內的遺傳距離均小于與其他品種間的遺傳距離。

表2 基于核GAPDH的和田沙漠玫瑰與3個玫瑰品種之間的遺傳參數

基于4個品種118個GAPDH克隆序列構建的系統發育樹(圖2)表明，大馬士革玫瑰19個克隆聚為兩個分支，紫枝玫瑰、豐花玫瑰的部分克隆序列分別聚為獨立分支(Zizhi、Fenghua)，它們兩個的部分序列聚在一起(Zizhi & Fenghua分支)。和田沙漠玫瑰的59個克隆序列聚為3個支持率較高的分支，與其他3個玫瑰的克隆序列沒有混合聚類現象，表明和田沙漠玫瑰與其他3個玫瑰品種之間沒有共享克隆序列。

Hetian. 和田沙漠玫瑰；Zizhi. 紫枝玫瑰；Fenghua. 豐花玫瑰；Damask. 大馬士革玫瑰；分支上的數字為自展值(BP)/后驗概率(PP)值；數字+字母組合(如2A)代表一條GAPDH克隆，其中數字代表個體編號，字母代表該個體的GAPDH克隆編號，下同

2.3 系統發育分析

基于GAPDH序列的薔薇屬系統發育樹(圖3)顯示和田沙漠玫瑰的序列聚到3個分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)中，分支Ⅰ包括了和田沙漠玫瑰克隆和碩苞薔薇(Rosabracteata，碩苞組sect.Bracteatae)、金櫻子(R.laevigata，金櫻子組sect.Laevigatae)、小果薔薇(R.cymosa，木香組sect.Banksiae)和木香花(R.banksiae，木香組)4個物種；分支Ⅲ由7個和田沙漠玫瑰克隆和橢葉薔薇(R.elliptica，sect.Caninae)、R.trachyphylla(sect.Caninae)、常綠薔薇(R.sempervirens，合柱組sect.Synstylae)和R.abyssinica(合柱組)4個物種聚成；分支Ⅱ由3個和田沙漠玫瑰克隆聚成，表明和田沙漠玫瑰與8個物種具有較近的親緣關系。豐花玫瑰、紫枝玫瑰、大馬士革玫瑰的克隆分別聚在5個分支(Ⅳ～Ⅷ)內。和田沙漠玫瑰與其他3個玫瑰品種之間無共享克隆序列。另外和田沙漠玫瑰的部分克隆位于系統發育樹的基部，說明和田沙漠玫瑰的遺傳組成比較古老。

分支上的數字為自展值(BP)/后驗概率(PP)值；--表示BP值低于50%或者PP低于0.5。下同

葉綠體DNA系統發育顯示，和田沙漠玫瑰與14個薔薇屬物種聚到分支Ⅰ中(圖4)，分別為Caninae組8個物種：犬薔薇(R.canina=R.vosagiaca)、凱西亞薔薇(Rosacaesia)、平葉薔薇(R.obtusifolia)、山地薔薇(R.montana)、亞卡薔薇(R.subcanina)、蘇氏薔薇(R.subcollina)和東方薔薇(R.orientalis)，法國薔薇組(sect.Gallicanae)3個物種：法國薔薇(R.gallica)、白薔薇(R.alba)和百葉薔薇(R.centifolia)，以及合柱組(sect.Synstylae)3個物種：萊舍魯薔薇(R.leschenaultiana)、腓尼基玫瑰(R.phoenicia)和常綠薔薇(R.sempervirens)。大馬士革玫瑰聚為分支Ⅱ；豐花玫瑰、紫枝玫瑰與玫瑰聚為分支Ⅲ，豐花玫瑰、紫枝玫瑰個體混合聚集，說明兩者親緣關系很近。和田沙漠玫瑰與其他3個玫瑰品種的個體沒有混合現象，表明它們之間的親緣關系較遠。

圖4 基于葉綠體DNA構建的薔薇屬系統發育樹Fig.4 The phylogeny of genus Rosa constructed with cpDNA

2.4 序列變異分析

和田沙漠玫瑰與近緣物種的GAPDH基因序列比對檢測到87個變異位點，和田沙漠玫瑰有19個雜合位點(表3)，其中若干種可能參與了和田沙漠玫瑰的形成，為其提供遺傳信息。對GAPDH和cpDNA系統發育分析獲得的與和田沙漠玫瑰具有較近親緣關系的17個物種進行葉綠體序列比對分析，發現凱西亞薔薇、萊舍魯薔薇、白薔薇、平葉薔薇、山地薔薇、亞卡薔薇與和田沙漠玫瑰的葉綠體序列完全一致；法國薔薇、百葉薔薇與和田沙漠玫瑰的葉綠體序列有1個堿基的差異；東方薔薇與和田沙漠玫瑰的葉綠體序列有2個堿基的差異，而犬薔薇、腓尼基玫瑰、常綠薔薇等物種與和田沙漠玫瑰序列差異較大(圖5)。

表3 和田沙漠玫瑰GAPDH基因的雜合位點

圖5 和田沙漠玫瑰品種與近緣薔薇屬物種的葉綠體DNA序列變異分析Fig.5 Sequence variation analysis of cpDNA for R. rugosa ‘Hetian shamomeigui’ and closely related Rosa species

3 討 論

和田地區自然地理環境和水土光熱條件獨特，氣候干旱、降水少蒸發高、晝夜溫差大，經過兩千多年的栽培實踐，培育了和田沙漠玫瑰品質好、豐產性好、抗逆性抗病蟲害的特點，在當地得到了大面積種植，并形成了成熟的種植加工產業鏈。然而一直以來，和田沙漠玫瑰與重瓣紅玫瑰之間的關系未進行明確研究，導致和田沙漠玫瑰無法作為普通食品進行生產經營，嚴重制約了和田地區玫瑰加工產業的發展。本研究表明，和田沙漠玫瑰品種內遺傳距離低于與豐花玫瑰、紫枝玫瑰、大馬士革玫瑰3個品種間的遺傳距離，與它們的遺傳相似性分別為0.971、0.976和0.978。系統發育分析表明和田沙漠玫瑰與其他3個玫瑰品種的無混合聚類關系，說明和田沙漠玫瑰與其他重瓣紅玫瑰(紫枝玫瑰、豐花玫瑰)不是同一品種，而是一個獨立的品種。

薔薇屬包含150～200個物種。Wissemann[12]根據薔薇物種表型特征將該屬劃分為4個亞屬——薔薇亞屬(Rosa)、單葉薔薇亞屬(Hulthemia)、Platyrhodon亞屬以及Hesperhodos亞屬。諸多學者開展了薔薇屬的分子系統學研究[6,13-16]，然而研究結果并不一致。傳統劃分的大部分亞屬、組均不是單系群[6]，這可能與薔薇屬較低的遺傳分化有關[13,15]以及屬內較弱的種間雜交障礙和頻繁的雜交有關[3-5]，雜交令屬內物種間的系統發育關系復雜化甚至混亂[13]，如基于核基因、葉綠體基因的系統發育關系不一致[15]。

本研究發現，基于核GAPDH和cpDNA獲得的系統發育樹的拓撲結構不一致，這可能與所用的物種不一致有關，部分物種或者只有核DNA數據或者葉綠體數據。和田沙漠玫瑰的GAPDH克隆序列聚在三個分支內，其中一個分支與來自中國或東南亞的碩苞組(sect.Bracteatae)、金櫻子組(sect.Laevigatae)、木香組(sect.Banksiae)物種聚在一起，且位于系統發育樹的基部位置，木香組2個物種(木香花、小果薔薇)和金櫻子組1個物種為中國特有種；碩苞組1～2種分布于東南亞；另一個分支與來自歐洲的Caninae組、合柱組(sect.Synstylae)、法國薔薇組(sect.Gallicanae)物種聚在一起；第三個分支包含較少的克隆，單獨聚為一個分支。葉綠體DNA的系統發育分析揭示的物種聚類情況與Fougère-Danezan等的研究[6]具有較高一致性，和田沙漠玫瑰與歐洲的14個薔薇屬物種親緣關系很近，這14個物種屬于Caninae組、法國薔薇組和合柱組。此外，序列變異分析發現和田沙漠玫瑰GAPDH的多個位點為雜合位點，和田沙漠玫瑰與部分歐洲物種葉綠體DNA序列一致或1～2個堿基的差異，與碩苞組、金櫻子組、木香組的3個物種存在9～11個堿基的差異。這些研究結果表明和田沙漠玫瑰與中國和歐洲的薔薇屬物種具有很近的親緣關系，其遺傳組成較為獨特，含有中國和歐洲物種的基因組分，暗示和田沙漠玫瑰的雜交起源。研究表明Caninae組的所有物種都可能是多倍體[6]，并且Caninae組、法國薔薇組、合柱組及其他組的一些物種為雜交物種(如百葉薔薇、白薔薇)，甚至作為雜交親本參與了薔薇屬物種或玫瑰品種的形成[8]。

現代玫瑰品種為雜交而來，8～20個物種參與了現代玫瑰雜交品種的形成[17-18]，如重瓣異味薔薇、野薔薇、月季花、紫月季花(R.chinensisvar.semperflorens)、香水月季(R.odorata)、大花香水月季、光葉薔薇(R.wichuraiana=R.luciae)、華西薔薇(R.moyesii)、碩苞薔薇(R.bracteata)、法國薔薇、麝香薔薇。DNA序列或者分子標記的研究有利于揭示薔薇屬物種或栽培品種的雜交起源。Iwata等[14]基于核ITS序列和葉綠體psbA-trnH序列研究發現麝香薔薇、法國薔薇、腺果薔薇(R.fedtschenkoana)3個物種是古大馬士革玫瑰變種(oldest Damask varieties)的原始雜交親本；Meng等[19]研究證明3個茶香月季(tea-scented China roses)品種香水月季(R.odoratavar.odorata)、橘黃香水月季(R.odoratavar.pseudindica)和粉紅香水月季(R.odoratavar.erubescens)由大花香水月季和月季花雜交而來。王開錦等[20]研究了十倍體中甸刺玫的系統位置及雜交起源，指出細梗薔薇、華西薔薇、尾萼薔薇、西南薔薇和西北薔薇是中甸刺玫的近緣野生種，其原始母本最可能是尾萼薔薇、西南薔薇和西北薔薇的其中之一或共同母本，細梗薔薇和華西薔薇極可能是其父本，而尾萼薔薇、西南薔薇和西北薔薇也可能以父本的身份參與了中甸刺玫的雜交物種形成。本研究發現，和田沙漠玫瑰其遺傳組成較為獨特，含有中國和歐洲物種的基因組分，這暗示和田沙漠玫瑰為雜交起源，并且其親本可能為中國物種和歐洲物種雜交而來，雜交親本可能為Caninae組、合柱組、法國薔薇組，碩苞組、金櫻子組、木香組，結合其葉綠體序列與歐洲物種序列一致，其母本可能是來自歐洲的Caninae組、合柱組、法國薔薇組的物種。和田沙漠玫瑰外形上與百葉薔薇相似，而百葉薔薇是法國薔薇、腓尼基玫瑰、麝香薔薇、犬薔薇的雜交后代(大馬士革玫瑰)與白薔薇雜交而來[21]。然而，現階段和田沙漠玫瑰雜交親本的推斷是基于目前基因數據庫已發表物種分析而得到的，結果具有一定局限性，例如，部分物種序列不全，有的物種有葉綠體序列而沒有核GAPDH序列，給準確判定和田沙漠玫瑰親本物種來源的帶來一定困難。后續需要對上述可能的親本物種展開采樣和研究，并通過生理生化性狀以及基因組SNP分析，明確和田沙漠玫瑰的雜交親本來源。

本研究基于分子數據揭示了和田沙漠玫瑰品種與重瓣紅玫瑰、大馬士革玫瑰品種的關系，探討了和田沙漠玫瑰的系統發育關系及其雜交起源，為進一步揭示和田沙漠玫瑰的起源和親本提供了基礎。和田沙漠玫瑰具有獨特的遺傳組成，品種內遺傳距離小于與其他3個品種的遺傳距離，在系統發育上，沒有與其他3個品種的序列發生聚集，因此，其遺傳上區別于豐花玫瑰、紫枝玫瑰、大馬士革玫瑰，應視為獨立的品種。系統發育和序列變異分析顯示和田沙漠玫瑰與來自中國或東南亞的碩苞組、金櫻子組、木香組，以及與歐洲Caninae組、合柱組、法國薔薇組物種聚在一起，表明和田沙漠玫瑰的雜交起源，并且可能為中國和歐洲薔薇屬物種或品種雜交而來，雜交親本可能為碩苞組、金櫻子組、木香組、Caninae組、合柱組、法國薔薇組的若干物種。