地黃RgMYB10基因的克隆與表達分析

李銘銘，索艷飛，左 鑫，李欣容，謝彩俠，王豐青*

(1 河南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，鄭州 450046； 2 河南中醫(yī)藥大學 藥學院，鄭州 450046)

轉(zhuǎn)錄因子是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過轉(zhuǎn)錄因子間及其他相關(guān)蛋白間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄[1]，保證目的基因在特定的時間與空間以特定的強度表達。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，轉(zhuǎn)錄因子一般由DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(激活區(qū)或抑制區(qū))、寡聚化位點以及核定位信號這4個功能區(qū)組成，其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達的機制為：功能區(qū)域與啟動子順式元件作用或與其他轉(zhuǎn)錄因子的功能區(qū)域相互作用[2]，DNA結(jié)合區(qū)決定了它與順式作用元件結(jié)合的特異性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)則決定了它對基因表達起激活或抑制作用。根據(jù)DNA結(jié)合區(qū)域的特點可將轉(zhuǎn)錄因子分為若干個家族，其中bZIP、WRKY、AP2/ERF和MYB這4類轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆中發(fā)揮著重要的作用[3]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是一個龐大的家族，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，其結(jié)構(gòu)上存在一段保守的DNA結(jié)合區(qū)-Myb結(jié)構(gòu)域，因而被稱為MYB類轉(zhuǎn)錄因子[4]。MYB基因根據(jù)其包含的結(jié)構(gòu)域數(shù)目的不同可將它分為4個亞類：第1類為只含有1個R結(jié)構(gòu)域的R1-MYB亞類；第2類是含有2個R結(jié)構(gòu)域的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子亞類，此類是植物中存在數(shù)目最多的一種，具有廣泛的生物活性，參與植物體內(nèi)的各種生理生化活動；第3類為含有3個R結(jié)構(gòu)域的R1R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子亞類，其功能主要為調(diào)節(jié)細胞周期和細胞分化；第4類為含有4個R結(jié)構(gòu)域的4R-MYB轉(zhuǎn)錄因子亞類，目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)量較少，對其研究也較少[5]。MYB轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物激素、次生代謝物和環(huán)境之間的互作，細胞的分化、器官的形成、葉片形態(tài)的建成及生物脅迫和非生物脅迫等過程中起著重要的作用，幾乎參與了植物生長發(fā)育過程中的各個方面，在植物的生命活動中起著至關(guān)重要的作用[6]。ZmMYBC1是第一個在植物中被發(fā)現(xiàn)的編碼MYB結(jié)構(gòu)域蛋白的基因，它參與了玉米(Zeamays)糊粉層中花青素的生物合成[7]。此后，隨著分子生物學和基因組學的快速發(fā)展，越來越多的植物MYB轉(zhuǎn)錄因子基因相繼被人們發(fā)現(xiàn)，其分子功能不斷得到解析。徐俊雄等[8]利用酵母單雜交技術(shù)分析出虎杖(Polygonumcuspidatum)MYB1具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，PcMYB1的轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)的株高與野生型相比降低24.07%，參與木質(zhì)素合成的5個相關(guān)基因下調(diào)表達，說明PcMYB1對木質(zhì)素合成起負調(diào)控作用。王霜等[9]克隆苦蕎(Fagopyrumtataricum)中1個與黃酮代謝相關(guān)的MYB基因FtMYB23，功能研究發(fā)現(xiàn)其對花青素的合成與積累起到促進的作用。在擬南芥中過表達人參(Panaxginseng)MYB4基因，可顯著提高植株的耐旱能力[10]。Chu等[11]在大豆(Glycinemax)的毛狀根中過表達GmMYB29基因，使大豆毛狀根異黃酮含量提高到1.6～3.3倍，相反地，基因沉默(RNAi)株系中異黃酮的含量降低為對照的1/2。茉莉酸甲酯(MeJA)作為一種重要的信號分子，可誘導植物次生代謝產(chǎn)物的積累，在植物次生代謝途徑研究中廣泛應用，同時也在植物抵抗逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[12]。丹參(Salviamiltiorrhiza)經(jīng)MeJA處理后SmMYB7的表達量上調(diào)，可提高丹參對逆境的防御[13]，并且MeJA處理可以顯著提高丹參毛狀根中丹參酮類成分的積累[14]。MeJA可誘導甘草(Glycyrrhizauralensis)懸浮細胞中MYB10基因和菘藍(Isatisindigotica)MYB4基因的表達[15-16]，為進一步探索其分子功能奠定基礎(chǔ)。

地黃(Rehmanniaglutinosa)為玄參科(Scrophulariaceae)地黃屬多年生草本植物，以塊根入藥，是中國著名的“四大懷藥”之一。因其含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類、酚酸、多糖、紫羅蘭酮等活性成分，而具有抗腫瘤、保護神經(jīng)、抗糖尿病及其并發(fā)癥、增強免疫等多種藥理活性[17-18]。其指標性成分之一毛蕊花糖苷具有抗氧化[19]、抗炎[20]、保肝[21]、增強記憶力[22]和免疫調(diào)節(jié)[23]等多種功能。課題組前期推導優(yōu)化了毛蕊花糖苷的生物合成途徑，鑒定出219個可能參與地黃毛蕊花糖苷合成的轉(zhuǎn)錄本，基于它們的表達模式篩選出與毛蕊花糖苷積累一致的關(guān)鍵候選基因[24]。然而，轉(zhuǎn)錄因子在地黃毛蕊花糖苷合成中的分子功能迄今未見報道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的SA和MeJA可顯著誘導提高地黃毛狀根中的毛蕊花糖苷含量[24]。宋小峰等[25]也發(fā)現(xiàn)，用MeJA處理地黃的毛狀根，毛蕊花糖苷含量在誘導后的第二天達到峰值，為對照的1.41倍。本研究從課題組前期篩選出與毛蕊花糖苷積累一致的候選基因中，檢索到1個注釋為MYB的核酸序列，應用分子手段對它進行PCR克隆，并對其分子結(jié)構(gòu)特征和進化關(guān)系進行分析，檢測地黃MYB基因在不同部位的表達量和響應誘導子的表達特性，以期揭示其在地黃毛蕊花糖苷合成中所發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以懷地黃品種‘溫85-5’為材料，經(jīng)福建農(nóng)林大學張重義教授鑒定為R.glutinosa。種植于河南武陟百療懷藥科技開發(fā)有限公司的基地，在地黃出苗后90 d取樣，分別取塊根、須根、莖、嫩葉、初展開葉、老葉的鮮樣于液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以實驗室培養(yǎng)的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)A4誘導的‘溫85-5’毛狀根為誘導子處理的材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄將備用樣品每個稱取50 mg，采用寶生物的RNA提取試劑盒提取地黃的總RNA(方法參照說明書進行)。反轉(zhuǎn)錄采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行。用于cDNA第1鏈合成需要約2 μg的總RNA，1 μL oligo dT(50 μmol·L-1)引物，1 μL dNTP，0.5 μL RNase抑制劑(40 U·μL-1)，1 μL Prime Script Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶(200 U·μL-1)，最后加入去離子水至總體積20 μL。反應程序為：65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 2 min。

1.2.2 cDNA克隆從GenBank中下載擬南芥MYB基因的核酸序列，利用軟件BLASTn在地黃轉(zhuǎn)錄組文庫中進行同源搜索，對獲得的序列利用在線軟件ORF Finder進行開放閱讀框(ORF)預測，獲得1個具有完整ORF的MYB10基因。根據(jù)基因編碼區(qū)設(shè)計特異性引物來擴增包含完整編碼區(qū)的cDNA片段，引物具體序列見表1。以地黃的cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為25 μL，包括5×PrimeSTAR?Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，正向引物(10 μmol·L-1)和反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶0.25 μL，添加16.25 μL的ddH2O。PCR擴增程序：98 ℃預變性30 s，98 ℃變性10 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)2次，退火溫度梯度降低至55 ℃，最后循環(huán)20次，72 ℃延伸5 min。PCR反應結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測電壓為120 V，時間為30 min。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工測序，確定基因的正確序列。

1.2.3MYB10基因的生物信息學分析利用NCBI在線分析軟件ORF Finder(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/)分析其開放閱讀框，運用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，利用在線軟件Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和序列編輯軟件GENEDOC對氨基酸進行多序列聯(lián)配分析，用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/)預測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，用在線分析軟件MAFFT和離線軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 誘導子處理地黃毛狀根以發(fā)根農(nóng)桿菌A4誘導的‘溫85-5’的毛狀根為處理材料，在MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)30 d，進行誘導子處理。誘導子種類和濃度分別為：25 μmol·L-1SA、5 μmol·L-1Ag+、5 μmol·L-1MeJA和15 μmol·L-1Put。分別在添加誘導子后的3、9、12和24 h取樣置于液氮，之后于-80 ℃冰箱保存，以未添加誘導子的毛狀根作為對照。

1.2.5 基因表達量檢測用1.2.1的方法提取地黃不同組織部位和誘導子處理后的毛狀根的總RNA并經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄后進行基因表達量的檢測。用Bio-Rad iQ5儀器進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的檢測。根據(jù)地黃MYB基因的編碼序列信息設(shè)計特異引物(表1)，以RgTIP41為內(nèi)參基因。實時熒光定量分析試劑盒SYBR Premix Ex TapTMⅡ(Tli RNaseH Plus)。PCR擴增體系為：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，正向引物(10 μmol·L-1)1 μL，反向引物(10 μmol·L-1)1 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，共計25 μL。反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt計算MYB基因的相對表達量。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

地黃MYB基因PCR擴增結(jié)果(圖1)顯示，擴增產(chǎn)物在750 ～1 000 bp之間，經(jīng)測序該序列全長875 bp。ORF Finder預測結(jié)果顯示，該序列包含一個完整的開放閱讀框，推測其編碼的蛋白質(zhì)序列為247 aa，將其命名為RgMYB10。序列已經(jīng)提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，注冊號為KR780086。

M. DL2000；1. RgMYB10

2.2 RgMYB10的序列特征分析

應用Ex PASy在線軟件計算RgMYB10蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RgMYB10編碼蛋白由247個氨基酸組成，原子總數(shù)為3 913，分子式為C1247H1911N347O396S12，預測其相對分子質(zhì)量為28.48 kD，理論等電點為5.14，說明這個蛋白偏酸性。蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為49.13，說明其為不穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水系數(shù)為-0.846，說明該蛋白是親水性蛋白。應用NCBI在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和在線軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/batch.pl)對RgMYB10基因所編碼的氨基酸序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果如圖2所示，RgMYB10蛋白具有2個SANT結(jié)構(gòu)域，即屬于MYB家族中的R2R3家族。分別在第13～63和66～114個氨基酸處各為一個SANT結(jié)構(gòu)域，在第151～165和193～210個氨基酸處有2個成分復雜度較低的區(qū)域。

圖2 地黃RgMYB10蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domains of R. glutinosa RgMYB10 protein

2.3 RgMYB10蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和多序列比對

為了進一步了解RgMYB10蛋白的功能和進化特征，從NCBI上下載了與RgMYB10相似性較高的9個物種的氨基酸序列，利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/)將這些蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域的預測。如圖3所示，預測結(jié)果表明，10個物種中除松蒿以外，其他9個物種均具有3個相同且保守的基序(Motif)，說明RgMYB10在進化過程中相對保守，并且，Motif1、Motif2和Motif3均為保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。利用GENEDOC對這10個MYB蛋白進行多序列聯(lián)配，如圖4所示，這10個MYB蛋白在N端高度保守，共同擁有R2R3 DNA結(jié)合區(qū)，其中包含一系列高度保守的色氨酸(Trp)殘基，而在C端差異很大，進一步說明RgMYB10在進化過程中具有一定的保守性。

Rg，地黃；Hi，紫花風鈴木；Sm，丹參；Pj，松蒿；Si，芝麻；Pa，銀白楊；Pt，毛果楊；Hs，木槿；At，擬南芥；Os，水稻

*MYB結(jié)構(gòu)域保守的色氨酸(W)殘基。Rg.地黃；Hi.紫花風鈴木；Sm.丹參；Pj.松蒿；Si.芝麻；Pa.銀白楊；Pt.毛果楊；Hs.木槿；At.擬南芥；Os.水稻

2.4 RgMYB10的3D結(jié)構(gòu)預測及二級結(jié)構(gòu)分析

用SWISS-MODEL在線軟件(http://swissmodel.expasy.org/interactive)對RgMYB10蛋白進行3-D建模，結(jié)果如圖5所示，RgMYB10以6kks.1.A為建模模板，序列一致性為57.52%，在空間上都包含6個α螺旋。利用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預測RgMYB10蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，RgMYB10基因編碼的蛋白質(zhì)由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，分別占總蛋白的34.82%、4.05%、55.47%和5.67%。

圖5 地黃RgMYB10蛋白的三維結(jié)構(gòu)預測模型Fig.5 Three-dimensional structure prediction model of R. glutinosa RgMYB10 protein

2.5 RgMYB10的系統(tǒng)進化分析

以地黃MYB10蛋白的氨基酸序列在NCBI上進行同源搜索，將獲取的同源蛋白用MEGA 7.0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果(圖6)表明，RgMYB10蛋白與其同源蛋白分成3個不同類群，3個類群均聚在一起的概率皆為100%，可信度非常高。RgMYB10與同為玄參科松蒿的同源蛋白PjMYB4(GFP99600.1)聚在一起，概率為67%，序列相似性為64.63%，與獨腳金(Strigaasiatica)同源蛋白SaMYB(GER55192.1)的序列相似性為56.8%，與猴面花(Erythrantheguttata)同源蛋白EgMYB4(XP_012828913.1)的序列相似性為58.17%，與芝麻同源蛋白SiMYB14(XP_011080041.1)的序列相似性為62.7%，與紫花風鈴同源蛋白HiMYB(PIN01206.1)的序列相似性為58.96%，它們的親緣關(guān)系較近，同屬類群Ⅰ。同屬于楊柳科的銀白楊、毛果楊和胡楊(Populuseuphratica)的MYB同源蛋白聚在一起，同屬類群 Ⅱ。單子葉植物水稻、玉米和高粱(Sorghumbicolor)的MYB同源蛋白聚在一起，同屬類群 Ⅲ。進化分析結(jié)果表明RgMYB10在進化上相對保守，不同物種間的關(guān)系符合物種進化規(guī)律。

圖6 地黃RgMYB10的分子進化系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Molecular evolutionary phylogenetic tree of R. glutinosa RgMYB10

2.6 RgMYB10基因組織特異性表達分析

分析了RgMYB10基因在地黃塊根、須根、莖、嫩葉、初展開葉和老葉6個組織中的表達量，結(jié)果(圖7)表明，RgMYB10基因在6個地黃組織中均有表達，且在不同的組織器官中呈現(xiàn)不同的表達模式。RgMYB10在須根中的表達量最高，達到399.97，莖中次之為100.73，在塊根中的表達量非常低，僅為1.02。隨著葉片的生長發(fā)育，由嫩葉到初展開葉再到老葉，表達量先升高后降低，在初展開葉中最高，達到30.42，老葉次之為25.35，嫩葉最低為5.53。根據(jù)表達量的結(jié)果，RgMYB10在須根中的表達明顯高于其他5個部位，可推測RgMYB10為須根中特異表達的基因，在須根中起到非常重要的生物學作用。

TR. 塊根；AR. 須根；S. 莖；TL. 嫩葉；UL. 初展開葉；SL. 老葉。不同小寫字母表示基因表達量在不同組織中有顯著差異(P<0.05)

2.7 RgMYB10基因響應誘導子處理的表達特性

為了分析RgMYB10基因響應外源誘導子的表達，在地黃毛狀根培養(yǎng)30 d時分別添加SA、Ag+、Put和MeJA，在處理后的3、9、12、24 h取樣，提取總RNA，應用qRT-PCR檢測RgMYB10的表達量。如圖8所示，在SA處理后，所檢測的4個時間段內(nèi)RgMYB10基因的表達量均沒有上調(diào)，且在9 和24 h顯著低于對照。Ag+作用下，在處理后的3和9 h，與對照相比表達量有所上升，在處理后3 h達到最大，為對照的1.83倍，隨后持續(xù)下降，在6 h時為對照的1.81倍，之后低于對照。MeJA處理后，在所檢測的4個時間內(nèi)，地黃RgMYB10基因的表達量與對照相比均顯著上調(diào)，處理后3 h達到峰值，為對照的30.5倍，隨后表達量有所下降但都顯著高于對照，在處理后24 h表達量最低但仍為對照的11.7倍。Put作用下基因表達量變化規(guī)律同Ag+，同樣在處理后3 h達到峰值，為對照的5.9倍，隨后持續(xù)下降在6 h為對照的2.5倍，之后低于對照。由此可以看出，地黃RgMYB10是特異響應MeJA誘導上調(diào)表達的基因。

* 表示與對照相比在0.05水平上存在顯著差異

3 討 論

MYB轉(zhuǎn)錄因子不但是植物生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，而且在植物的多種次生代謝途徑中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[26]，其中，R2R3-MYB亞家族是植物中發(fā)現(xiàn)的最豐富的MYB家族，廣泛參與植物黃酮類[27-29]、萜類[30-31]和苷類[32]化合物的生物合成。本研究利用分子手段克隆了地黃的1個MYB(RgMYB10)基因，結(jié)構(gòu)分析表明，RgMYB10編碼的蛋白由247個氨基酸組成，N端具有2個SANT結(jié)構(gòu)，屬于典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征，2個結(jié)構(gòu)域分別由51和49個氨基酸組成，并且這兩個結(jié)構(gòu)域中含有典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子所特有的保守的色氨酸殘基W，因此，克隆的地黃RgMYB10為R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。

MeJA作為內(nèi)源信號分子參與植物在干旱、低溫、鹽脅迫、機械傷害、病蟲害等條件下的抗逆反應，保護植物免受生物和非生物脅迫[33]。研究表明，15～60 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)的MeJA處理可減輕甘草的氧化脅迫，增強其碳和氮代謝，促進鹽脅迫下甘草幼苗的生長[34]，10 μmol·L-1MeJA處理煙草幼苗可降低低溫對植物體的損傷[35]。同時，MeJA作為基因調(diào)控的誘導子，對參與植物次生代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)基因的表達起到調(diào)控作用，進而調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物的合成與積累[36]。Li等[37]在甘草懸浮細胞中加入MeJA，甘草GlMYB4和GlMYB88的表達量明顯增加，過量表達GlMYB4和GlMYB88基因的甘草懸浮細胞中，類黃酮的含量均顯著提高。張文娟等[38]用MeJA誘導大戟(Euphorbiapekinensis)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)大戟愈傷組織中總?cè)频暮刻岣?，大戟三萜類成分合成途徑中的HMGR、SQS和FPS基因的表達量也顯著增加。行冰玉等[39]研究表明，丹參懸浮細胞經(jīng)外源施用MeJA處理后，提高了迷迭香酸生物合成途徑中苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(TAT)的生物活性，進而顯著提高愈傷細胞中迷迭香酸的積累量。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在地黃毛狀根中添加適宜濃度的MeJA可顯著促進毛蕊花糖苷的積累[24]，說明MeJA正向調(diào)控了地黃毛蕊花糖苷的生物合成，因此，通過檢測MeJA添加后地黃毛狀根中RgMYB10基因的表達量有助于揭示其在毛蕊花糖苷合成中的分子功能。

植物體中，關(guān)鍵催化酶基因和轉(zhuǎn)錄因子基因的表達與植物次生代謝產(chǎn)物的合成與積累存在一定的相關(guān)性?？悼∶返萚40]研究表明，過表達苜蓿(Medicagosativa)皂甙合成途徑中的關(guān)鍵限速酶——苜蓿鯊烯環(huán)氧酶(MsSQE1)后，轉(zhuǎn)基因株系中MsSQE1的表達量最高為對照的9.45倍，同時，總皂苷的含量相比對照提高14.26%～28.05%。Cui等[41]對丹參SmCPS1基因進行靶向沉默(RNAi)，沉默株系與野生型(WT)相比，RNAi植株表現(xiàn)出明顯的白色根表型，WT為紅色，根中的次生代謝產(chǎn)物隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的含量顯著降低。已有的研究表明，地黃植株不同部位的毛蕊花糖苷含量有很大差異。地黃葉片中的毛蕊花糖苷含量遠高于塊根[42]，須根中的毛蕊花糖苷含量明顯高于塊根韌皮部、木質(zhì)部和周皮[43]，展開葉和衰老葉中含有較多的毛蕊花糖苷[24]。本研究發(fā)現(xiàn)RgMYB10在須根中表達量最高，其次為莖，在塊根中的表達量最低，隨著葉片生育期的延長，由嫩葉、初展開葉到衰老葉，RgMYB10基因的表達量呈先升后降的趨勢，說明RgMYB10基因在地黃不同器官的表達模式與毛蕊花糖苷的含量變化具有一定的正相關(guān)性。而且，在MeJA的誘導下，地黃毛狀根中RgMYB10的表達量大幅度增加，而其他3種誘導子對RgMYB10的表達量沒有促進作用，說明RgMYB10可以特異響應MeJA的誘導，可能是響應MeJA處理促進毛蕊花糖苷合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其分子調(diào)控機制仍需進一步的研究。