CDPK20基因表達(dá)及其對(duì)山藥塊莖膨大調(diào)控作用研究

王金鑫，季 祥，高圓麗，張艷芳，邵 盈，邢麗南，霍秀文

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植保學(xué)院， 呼和浩特010019)

山藥(DioscoreaoppositaThunb.)是薯蕷屬植物地下塊莖的俗稱，別名薯蕷、白苕等。山藥塊莖利用價(jià)值很高，既可以當(dāng)中藥來用，也可以作為蔬菜被人們食用，是世界上重要的十大食用塊莖植物之一[1]。塊莖作為山藥的主要產(chǎn)品器官，其生長發(fā)育過程較為復(fù)雜，涉及各種物質(zhì)成分的積累以及相關(guān)酶活性變化[2]。因此，在相關(guān)代謝酶活性以及塊莖膨大相關(guān)基因方面做進(jìn)一步的深入研究,可以為山藥塊莖品質(zhì)的提高和育種提供理論依據(jù)。

鈣作為植物的基本元素之一，既可穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，還可以中和植物代謝中產(chǎn)生的酸。在植物中有3種蛋白質(zhì)可以與鈣離子(Ca2+)特異性結(jié)合并進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。它們是鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)、類鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like,CBL)和鈣依賴性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)，其中，CDPK與Ca2+結(jié)合后，直接將Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)換為磷酸化信號(hào)，將Ca2+信號(hào)傳遞并放大，促進(jìn)植物產(chǎn)生響應(yīng)蛋白[3-5]。研究表明CDPKs存在復(fù)雜的調(diào)控模式，在植物生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)中均扮演重要角色。田曉涵等[6]在對(duì)陸地棉的研究中發(fā)現(xiàn)，通過誘導(dǎo)過表達(dá)GhCDPK1基因可以使植株積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)酶的活性和維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性來提高植物抵御外界干旱脅迫的能力。ABA是一種重要的逆境激素,CDPKs參與了由ABA調(diào)節(jié)的植物對(duì)干旱和鹽脅迫的響應(yīng)過程。有研究表明ABA可以通過某種途徑活化 CDPK1和CDPK1a等蛋白激酶，誘導(dǎo)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)[7]。徐夢(mèng)軍等[8]對(duì)小麥研究發(fā)現(xiàn)TaCPK34表達(dá)量與籽粒淀粉積累速率呈顯著正相關(guān)，推測該激酶參與小麥籽粒淀粉合成的調(diào)控，這是首次有關(guān)該激酶參與作物淀粉合成的報(bào)道。目前鈣依賴性蛋白激酶在山藥生長發(fā)育方面的研究較少，所以本研究通過測定山藥塊莖淀粉、糖、內(nèi)源激素等含量、CDPK酶活性，克隆編碼鈣依賴性蛋白激酶基因的開放閱讀框(ORF)，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位，比較‘畢克齊’和‘大和長芋’山藥的CDPK酶活性及CDPK20在不同時(shí)期的差異表達(dá)，從而探究其在山藥塊莖膨大過程中對(duì)淀粉糖代謝及內(nèi)源激素方面的作用，為山藥分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以內(nèi)蒙古山藥塊莖形態(tài)差異明顯的畢克齊山藥(B1)和大和長芋山藥(DHCY)為試驗(yàn)材料，于2019年4月初種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)山藥種質(zhì)資源研究圃，取樣時(shí)期為種植后的105 d(T1)、120 d(T2)、135 d(T3)、150 d(T4)和165 d(T5)，挖取長勢均勻的塊莖，每個(gè)時(shí)期取3株作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共3次重復(fù)，用于生理指標(biāo)的測定。每株每次稱取1 g塊莖，3株混樣，用錫紙包好標(biāo)記，液氮速凍，-80 ℃冰箱中保存，用于基因克隆及表達(dá)分析。

1.2 方 法

1.2.1 生理指標(biāo)的測定參考本課題組敖蘭吉亞[9]的方法，對(duì)5個(gè)取樣時(shí)期塊莖的淀粉、可溶性糖及還原糖含量進(jìn)行測定，內(nèi)源激素ABA、GA3、IAA和ZR的含量測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，每個(gè)樣品測定3次，取平均值。所用試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院提供，CDPK活性測定試劑盒由江蘇酶標(biāo)生物科技公司提供，每個(gè)樣品測定3次，取平均值。

1.2.2 山藥塊莖總RNA的提取及cDNA合成采用RNA提取試劑盒(TaKaRa Mini Best Plant RNA Extraction Kit)提取不同發(fā)育時(shí)期塊莖的總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，用TaKaRa公司的(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA SynthesisKit)試劑盒反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。

1.2.3CDPK20的ORF的克隆從本實(shí)驗(yàn)室前期通過高通量測序完成的山藥塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，得到鈣依賴性蛋白激酶基因(CDPK20,Unigene 0032301)序列。通過Primer Premier 5.0軟件在CDPK20的ORF兩端設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為Extaq 25 μL,CDPK20-ORF-F和CDPK20-ORF-R (10 μmol·L-1) 各1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物取10 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。并將PCR產(chǎn)物回收純化，連接到T載體上克隆并測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析運(yùn)用NCBI中的ORF finder查找CDPK20的開放閱讀框；在蛋白質(zhì)生物信息學(xué)網(wǎng)站Expasy(https://web.expasy.org)進(jìn)行蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析。運(yùn)用NCBI中的Blast進(jìn)行氨基酸序列同源性搜索，運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 亞細(xì)胞定位設(shè)計(jì)含有BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的引物(表1)，進(jìn)行ORF的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為Extaq 25 μL，CDPK20-SF和CDPK20-SR(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。將產(chǎn)物擴(kuò)增后回收純化并連接到T載體上，轉(zhuǎn)化TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液陽性克隆PCR快速鑒定。將鑒定后得到的菌落接種到LB(含有濃度為100 μg·mL-1的Amp)液體培養(yǎng)基上，搖床振蕩培養(yǎng)，使用TIANGEN公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。使用內(nèi)切酶BamH Ⅰ和KpnⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并回收。最后將酶切后的CDPK20編碼序列與載體質(zhì)粒的回收產(chǎn)物使用T4DNA 連接酶連接，完成表達(dá)載體的構(gòu)建。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞Trans T1中，涂板挑選單克隆，經(jīng)菌液PCR陽性克隆檢測后送南京金斯瑞生物工程有限公司測序驗(yàn)證。將重組質(zhì)粒以及空載質(zhì)粒用煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入煙草中，激光共聚焦顯微鏡觀察CDPK20定位。

表1 CDPK20相關(guān)的引物序列

1.2.6CDPK20的表達(dá)分析使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行CDPK20基因的qRT-PCR分析。反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL(200 ng·μL-1)，CDPK-qF和CDPK-qR各1 μL(10 μmol·L-1)，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 25 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s；每個(gè)樣品3次重復(fù)。利用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并制圖，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥塊莖膨大過程中生理指標(biāo)分析

在山藥塊莖膨大過程中，淀粉含量呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，在T2～T3二者淀粉含量顯著升高，在T3時(shí)二者淀粉含量存在顯著性差異(圖1，A)；可溶性總糖含量二者的變化趨勢一致，均表現(xiàn)出先降后升趨勢，且在T1～T2顯著下降，可溶性總糖含量DHCY在各個(gè)取樣點(diǎn)均高于B1(圖1，B)；還原糖含量二者均表現(xiàn)出先降后升趨勢，T2時(shí)二者的還原糖含量存在顯著差異(圖1，C)；CDPK活性均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在T4時(shí) B1和DHCY酶活性達(dá)到最高峰，分別為72.80 mg·g-1·h-1和77.49 mg·g-1·h-1(圖1，D)。

在B1和DHCY中內(nèi)源激素GA3變化趨勢不相同，在B1中呈“升-降-升-降”雙峰變化趨勢，且在T2時(shí)顯著高于其他時(shí)期；而DHCY呈相反的“降-升-降-升”變化趨勢，在T3和T5時(shí)顯著高于其他時(shí)期(圖1，E)。B1和DHCY中內(nèi)源激素IAA呈相一致的先升后降變化趨勢，DHCY始終高于B1，且在T1～T3、T5時(shí)DHCY顯著高于B1(圖1，F(xiàn))。內(nèi)源激素ABA含量二者變化趨勢相同，B1的內(nèi)源激素ABA含量高于DHCY，且在T1、T2、T3和T5二者差異性顯著(圖1，G)。內(nèi)源激素ZR整體呈先升后降的趨勢，且在T2和T4時(shí)，B1顯著高于DHCY(圖1，H)。

B1. 畢克齊；DHCY. 大和長芋；T1、T2、T3、T4、T5.分別為種植后的105 d、120 d、135 d、150 d、165 d；不同小寫字母表示在0.05不同品種及不同時(shí)期水平顯著差異。下同

2.2 CDPK20基因的克隆

以山藥塊莖cDNA為模板，CDPK20-ORF-F和CDPK20-ORF-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為1 000 bp的明亮目的條帶(圖2)，回收該克隆條帶連接T載體挑取陽性克隆后測序，測序結(jié)果表明該片段實(shí)際大小為1 149 bp，用 ORF Finder分析表明CDPK20基因的ORF片段為1 047 bp，共編碼348個(gè)氨基酸(圖3)。

M. DL2000；1. PCR產(chǎn)物

圖3 山藥塊莖CDPK20 的ORF序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 The ORF sequence of yam tuber CDPK20 and its deduced amino acid sequence

2.3 生物信息學(xué)分析

對(duì)山藥CDPK20蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，其分子式為C1775H2782N474O515S14，理論等電點(diǎn)為5.58，為酸性。預(yù)測為非跨膜、親水蛋白；主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)構(gòu)成。通過DNAMAN軟件進(jìn)行多個(gè)物種CDPK20氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，山藥CDPK20氨基酸序列與蘆筍、菠蘿、鐵皮石斛、椰子、油棕、海棗、睡蓮、小蘭嶼蝴蝶蘭、高粱序列相似性較高,分別為86%、85%、85%、85%、85%、84%、84%、84%和81%(圖4)。利用MEGA 5.0軟件將山藥CDPK20蛋白其他9種植物的同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果表明山藥與鐵皮石斛、小蘭嶼蝴蝶蘭之間的親緣關(guān)系最近(圖5)。

圖5 山藥塊莖CDPK20的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of CDPK20 of yam

XP_020092263.1. 菠蘿；XP_002463047.1. 高粱；XP_008810968.1. 海棗；XP_020257982.1. 蘆筍；XP_031488036.1. 睡蓮；XP_020682170.1. 鐵皮石斛；XP_020574779.1. 小蘭嶼蝴蝶蘭；EHA8588299.1. 椰子；XP_010923436.1. 油棕

2.4 CDPK20的亞細(xì)胞定位

將檢測成功的農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)入煙草葉片中,黑暗中培養(yǎng)過夜后,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

GFP-CK為對(duì)照，GFP熒光信號(hào)均勻分布于煙草細(xì)胞內(nèi)部,發(fā)現(xiàn)CDPK20-GFP熒光信號(hào)在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中較強(qiáng)(圖6)。

GFP. 綠色熒光蛋白； DAPI. 細(xì)胞核染色； DIC. 明場；Merge. 疊加場； 標(biāo)尺=40 μm

2.5 山藥不同時(shí)期CDPK20基因表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果表明，B1和DHCY在整個(gè)膨大期均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；且二者均在T1～T2表達(dá)量顯著升高；在T4時(shí)二者存在顯著差異并且表達(dá)量達(dá)最高值,B1高出DHCY 2.14倍(圖7)。

圖7 山藥塊莖生長發(fā)育過程中CDPK20相對(duì)表達(dá)量變化Fig.7 Changes of CDPK20 expression during yam tuber development

2.6 相關(guān)性分析

B1中CDPK酶活性與還原糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與IAA含量呈顯著正相關(guān)，與ABA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。在DHCY中，CDPK活性與淀粉含量、ZR含量呈極顯著正相關(guān)，與可溶性總糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)；與還原糖呈負(fù)相關(guān)。兩品種山藥中的IAA、ZR含量與淀粉含量呈極顯著正相關(guān)，與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān)，IAA和ZR可能有助于淀粉積累和還原糖分解，為山藥塊莖膨大提供能量(表2)。在DHCY中ABA含量與還原糖呈極顯著正相關(guān)，植物體內(nèi)的ABA有助于器官的成熟，從而促進(jìn)還原糖的合成。B1和DHCY中酶活性與基因表達(dá)量均呈極顯著正相關(guān)(表3)。

表2 2個(gè)品種山藥塊莖生理指標(biāo)的相關(guān)性

表3 2個(gè)品種山藥塊莖CDPK酶活性與基因表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

CDPKs廣泛存在于植物界，從綠藻到高等植物，是目前植物中研究較多、了解較為清楚的一類蛋白激酶。徐夢(mèng)軍等[8]對(duì)小麥TaCPK34基因沉默后發(fā)現(xiàn)成熟籽粒中粒長、粒寬、千粒重和淀粉含量均顯著下降，表明TaCPK34可能參與小麥籽粒淀粉的合成。而本研究中CDPK酶活性與淀粉含量呈極顯著正相關(guān)，與還原糖、可溶性糖含量均呈顯著負(fù)相關(guān)，在塊莖膨大前期需要消耗糖來提供山藥塊莖膨大所需要的能量，同樣可表明CDPK在淀粉及糖代謝中發(fā)揮某些重要作用。研究表明，CDPKs參與調(diào)控植物激素信號(hào)通路，可以通過影響GA20ox和GA3ox來調(diào)控活性GA的合成[10]。CDPKs還參與ABA誘導(dǎo)的氣孔運(yùn)動(dòng)和響應(yīng)ABA信號(hào)，并且IAA處理能夠增加綠豆插條 CDPKs 基因的表達(dá)[11]。Sian等[12]對(duì)大麥糊粉層原生質(zhì)體用微量注射法注進(jìn)鈣依賴蛋白激酶的肽表明：激酶對(duì)GAs和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有調(diào)節(jié)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，B1的CDPK酶活性與ABA呈極顯著負(fù)相關(guān)，與GA3、IAA呈正相關(guān)，DHCY山藥中CDPK酶活性與激素ZR呈顯著正相關(guān)，表明CDPKs在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用。

CDPKs由Hetherington等[13]于1982年在豌豆(PisumsativumL.)中首先報(bào)道，目前CDPK家族基因已在多種植物中被發(fā)現(xiàn)并克隆。胡佳蕙等[14]從野生番茄‘潘那利’中克隆SpCPK8基因,亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜上，且表明SpCPK8基因能夠積極響應(yīng)干旱脅迫。雷蕾等[15]從茶樹龍井中克隆出CsCDPK17基因，證明CsCDPK17是細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核雙定位蛋白。趙婉瑩[16]克隆了表明小麥TaCDPK1基因，并表明該基因負(fù)向調(diào)控GA的合成，定位與細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。本研究對(duì)山藥塊莖的CDPK20基因進(jìn)行克隆，且亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜，CDPK20基因?qū)DPK酶有正向調(diào)控作用。CDPKs的亞細(xì)胞定位模式多樣，暗示其功能的多樣性。

CDPKs參與調(diào)控植物根、莖、葉的生長發(fā)育，植物的各種器官中均能檢測到CDPK基因的表達(dá)。王丹丹等[17]從朝鮮淫羊霍中克隆了EkCDPK，其在根、莖、葉中均有表達(dá)。有關(guān)玉米的研究表明，CDPK基因表達(dá)水平受到抑制時(shí)，花粉的萌發(fā)以及花粉管的延伸都受到了明顯的抑制作用[18]。梁述平等[19]通過研究煙草MCDPK1的表達(dá)，證明CDPK同源物會(huì)導(dǎo)致植物主枝花原基敗育還會(huì)延長側(cè)枝的營養(yǎng)生長期。馬鈴薯StCDPK1和StCDPK3在匍匐莖中表達(dá)，與塊莖早期發(fā)育和膨大相關(guān)[20]。陳暄等[21]克隆了茶樹中的鈣依賴蛋白激酶基因，并且在表達(dá)特異性分析中發(fā)現(xiàn)它只在茶樹花蕾發(fā)育后期進(jìn)行表達(dá)。本研究中CDPK20基因在塊莖膨大關(guān)鍵時(shí)期的表達(dá)量顯著升高，而B1的CDPK20基因表達(dá)量在膨大期略高于DHCY，這可能與B1在山藥塊莖膨大中期塊莖迅速伸長發(fā)育有關(guān)，其在山藥不同器官中的表達(dá)模式還需進(jìn)一步研究。不同植物中的CDPKs表達(dá)模式也不一定相同，越來越多的CDPKs基因正在從不同的植物中被克隆鑒定，CDPK雖不決定植物器官形成，但可能參與調(diào)控植物生長發(fā)育的過程。而CDPK在山藥中怎樣與下游蛋白互作、與哪些通路相關(guān)聯(lián)從而影響山藥塊莖膨大、以及其結(jié)構(gòu)和在淀粉、激素代謝中的功能還需進(jìn)一步研究。