動物布魯氏菌病活疫苗生產環節生物安全風險分析與對策

秦玉明，馮 宇，蔣 卉，彭小薇，許冠龍，朱良全，范學政，丁家波

(中國獸醫藥品監察所 國家/OIE布魯氏菌病參考實驗室，北京 102600)

布魯氏菌病(布病)是一種由布魯氏菌引起的慢性多器官損傷性人獸共患傳染病，我國將其列為二類動物疫病[1]。我國是畜牧業大國，牛羊豬等家畜的飼養量位居世界首位。在給人民群眾提供豐富肉蛋奶等動物產品的同時，也給動物疫病防控帶來巨大挑戰。近十年來，我國畜間和人間布病感染率居高不下，嚴重威脅畜牧業的發展和公共衛生事業，防控布病迫在眉睫。在布病流行的國家和地區，使用疫苗是一種必不可少且行之有效的方法。

目前我國生產的布病活疫苗主要有S2株、M5株/M5-90株、A19株和2020年注冊通過的A19-ΔVirB12株。2016年，四川省一家獸用生物制品企業發生個別生產人員感染布魯氏菌事件[2]。2019年甘肅省蘭州市布病抗體陽性聚集事件表明，獸用的布病弱毒活疫苗(S2株)雖然感染人的風險較低，但在防控不到位和特殊環境條件下，仍會對生產疫苗的操作工人產生感染風險，威脅直接接觸人員的身體健康。因此，農業農村部于2020年1月發布《農業農村部辦公廳關于切實加強獸用布氏菌病活疫苗生產安全監管工作的通知》[3]，要求布病活疫苗生產企業加強管理，尤其需要對生產布病活疫苗的生產操作區域(廠房與設施、菌種繁殖及發酵培養、配苗與分裝、凍干、軋蓋、貼簽與包裝)使用的專用設備以及在生產與檢驗及其設備維護過程中存在的生物安全風險進行識別與評估，并在風險評估基礎上需要采用有效的措施進行控制。在2020年4月頒布的新版《獸藥GMP規范》及隨后發布的《中華人民共和國農業農村部公告第292號》明確了新版《獸藥GMP規范》中生物制品的相關要求[4-5]，對生產布病活疫苗企業的質量管理、廠房與設施、生產管理、驗證與確認等進行規范。

本文對動物布病活疫苗的生產、檢驗、個人防護及環境監測管理等各環節中存在的主要生物風險進行識別，對易被忽視的主要生物安全風險點進行分析，并就如何加強生物安全風險防控進行論述，供獸藥生產企業及地方藥政管理部門監督檢查時參考。

1 主要生物安全風險點

1.1 硬件設備與設施

1.1.1 發酵罐 布魯氏菌活疫苗的生產首先需要通過發酵罐采取通氣培養方式實現擴大繁殖。因此，發酵罐是布病活疫苗生產最為重要和生物安全風險最大的生產設備之一。在布魯氏菌發酵培養過程中需要輸入氧氣和二氧化碳，同時還會產生廢氣。發酵罐內的菌液在不斷攪拌過程中產生大量含有布魯氏菌的氣溶膠，會隨著廢氣排出發酵罐外。發酵結束后，在對發酵罐進行在線原位滅菌(SIP)和在線清洗(CIP)中忽視對呼吸器滅菌效果驗證，也存在一定風險。

1.1.2 密閉的分裝、加塞、軋蓋聯動裝置 發酵培養結束后的菌液經沉淀濃縮處理后就進行配苗與分裝。布病活疫苗的分裝、加塞、軋蓋過程中除了要考慮避免環境中的微生物污染產品外，還要考慮分裝過程中因敞口或者非密閉操作過程中產生的氣溶膠給相關生產人員帶來的感染風險。在軋蓋過程中極少量壓碎、壓裂的疫苗瓶也會外包裝生產區散播大量布魯氏菌，在普通的開放的正壓環境下，也給操作人員帶來一定的生物安全風險。

1.1.3 凍干機 弱毒活疫苗需要經過凍干機的冷凍干燥過程。真空泵在冷凍干燥過程，疫苗瓶中升華的水蒸氣必然攜帶存活的布魯氏菌，直接排放就是對大氣環境散毒。在凍干結束后，疫苗瓶外壁也會存留少量分裝或者凍干過程中外溢到瓶壁上的布魯氏菌，給隨后軋蓋、貼內標簽的操作人員帶來感染風險。

1.1.4 高效過濾器 根據2020年版《獸藥GMP規范》和農業農村部相關規定，生產布病活疫苗車間涉及活菌的負壓環境，需在排風口安裝高效過濾器。高效過濾器性能好壞直接關系到車間內活菌排放風險。決定高效過濾器性能的主要是過濾效率和過濾阻力[6]。一旦其過濾效能未驗證，或未及時發現濾膜破損，則可能直接向環境散毒。

1.1.5 活毒廢水滅活罐 涉及活菌操作產生的廢水都需要收集到密閉罐內進行無害化處理。在處理過程中如果滅菌溫度不夠，或者滅菌溫度沒有維持到規定的滅活時間，或者在罐體上的溫度壓力等儀表出現數據漂移導致顯示不準確，都有可能出現滅活不徹底造成散毒風險。

1.1.6 生物安全柜 布魯氏菌從擴繁菌種到半成品及成品檢驗都需要使用生物安全柜。一般，成品活菌計數都會在生物安全柜內進行。一旦企業為生產方便，將疫苗種子逐級擴繁和半成品檢驗就在車間內的超凈工作臺內進行，就會對操作人員帶來暴露風險。此外，生物安全柜沒有進行定期校驗、沉降菌、風速等檢測，其也無法確定對操作人員起到保護作用。

1.1.7 負壓獨立隔離器(IVC) 一般弱毒活疫苗的安全檢驗僅需要正壓環境即可進行，但布病活疫苗成品安全檢驗必須使用負壓的獨立通風隔離器(IVC)。否則，小鼠體內增殖的布魯氏菌可能隨著糞便或者尿液排到IVC鼠籠內，隨著空氣排到環境中，對室內檢驗人員帶來生物安全風險。安全檢驗結束后，如果沒有先將IVC鼠籠原位消毒就移到清潔區外進行清洗和滅菌，也會散毒并造成清洗人員感染風險。

1.1.8 正壓呼吸頭套、N95口罩、眼罩等個人防護設備(PPE) 在涉及到活菌菌種擴繁、發酵擴大培養、分裝與軋蓋、半成品檢驗、成品檢驗或者車間設備維護維修過程中，相關的操作人員都有可能遇到存留的或者意外溢出的少量布魯氏菌。如果沒有根據操作工序風險大小選擇佩戴正壓呼吸頭套、N95口罩、眼罩等適宜的個人防護設備(PPE)，就可能造成人員感染風險。在重復使用正壓呼吸頭套或者其他防護設施后，一旦消毒效果不確實，也存在交叉感染的風險。

1.2 生產過程

1.2.1 生產工藝確認與變更 企業需要以農業農村部注冊批準的工藝規程制定適合自身的布病活疫苗工藝規程。該工藝規程一經審批就不能隨意變更，輕易變更其中的任何一項關鍵參數，都會對整個產品帶來不確定性。比如，更換新滅菌設備，按照原有參數可能導致滅菌效果不徹底；改變培養發酵一些參數，導致細菌生長曲線變動；改變培養方式，對產品質量產生不確定性風險。

1.2.2 有菌區潔凈級別的控制 布病活疫苗在涉及到開口暴露的分裝、凍干、加塞等生產過程中，很可能污染外源病微生物。因此，對相應的生產環境的潔凈界別要進行嚴格控制，防止產品污染環境中微生物，造成疫苗產品本身的安全性風險。

1.2.3 清潔滅菌方法驗證消毒劑配制及更換 在布病疫苗整個生產、檢驗、設備檢修及廢棄物無害化處理過程中，都涉及到對病原微生物的滅菌處理。發酵罐滅菌溫度維持不夠，或者活毒廢水滅活操作不合理，就會造成向環境散毒風險；日常清潔消毒擦拭的消毒液選擇或者配制不對[7-8]，就無法實現對殘留的病原菌的殺滅作用。

1.3 人員

1.3.1 相關人員生物安全知識培訓及效果評價 布病活疫苗在生產、檢驗甚至設備維護與檢修人員都有可能在工作中接觸到布魯氏菌活菌。尤其是布魯氏菌疫苗株種子批制備人員、發酵罐操作人員，分裝、軋蓋與凍干人員，半成品與成品活菌計數、成品安全檢驗、高效過濾器更換與維修人員，如果未經崗位培訓，或者培訓效果不好，在正常工作中就會有感染風險。

1.3.2 突發泄露事件的演練及環境監測 前面都是正常生產、檢驗、或者維修時可能遇到的暴露風險，但實際生產過程中難免會遇到意外發生。比如隔離服在操作中意外破損，正壓呼吸頭套故障，貼標簽發現破損疫苗瓶，高效過濾器泄露，負壓車間出現正壓情況，生物安全柜風速異常等等，都會對操作人員產生暴露風險。

2 應對措施

2.1 加強對涉及活菌操作中主要設備風險點的管控

2.1.1 加強對發酵罐的管理 對于發酵罐設置疏水型的呼吸閥并將排出氣體嚴格進行無害化處理。在發酵后期，伴隨氧氣和二氧化碳氣體的輸入及攪拌噴出的氣溶膠，需采取有效的氣體與液體分離技術，分別進行滅菌或者除菌措施。發酵結束后對罐體進行徹底的消毒滅菌時，要嚴格執行原位在線滅菌和在線清潔的操作規程，保護車間內人員免于布魯氏菌暴露感染風險。

2.1.2 采用分裝、加塞、軋蓋密封隔離系統 農業農村部在2020年版《獸藥GMP規范》中明確規定[4]，布病疫苗配制與分裝等過程中要采用隔離操作技術，在密閉的系統進行活菌操作。因此，企業應該采用處于負壓環境下的密封全自動灌、軋、消聯動的生產設施，既保證產品不會被環境微生物污染，也可以防止疫苗在配制、分裝、軋蓋等過程中產生的氣溶膠感染操作人員。

2.1.3 重視凍干機的管控 為防止凍干過程中將布魯氏菌排放到大氣中，必須將凍干機排放升華的水蒸氣進行無害化處理后才能排放到大氣環境中。在凍干結束后，還需要對凍干機箱體內的疫苗瓶外表面進行消毒，以防止外溢的少量殘留的布魯氏菌在貼內標簽過程中帶給操作人員的感染風險。現在，布病活疫苗在凍干結束出箱前會通過氧化氫、臭氧等氣體進行熏蒸或者噴灑不易揮發的對布魯氏菌非常敏感的消毒液進行滅菌。這就需要驗證熏蒸消毒對布病活疫苗保存期的影響。

2.1.4 尤其要重視排風口高效過濾器維護 在排風口的高效過濾器安裝阻力監測儀就可以實現對檢漏實時監測，防止生產過程中泄露的微生物污染大氣環境。企業還要評估制定高效過濾器的更換制度，以避免生產過程中泄露概率的發生。在排風口采用專用的袋進袋出過濾箱(BIBO)，也可以避免更換時箱體內氣體與外界接觸，BIBO過濾箱上配有手套，還方便工作人員安全操作。

2.1.5 注意生物安全柜、負壓的獨立通風隔離器(IVC)、活毒廢水滅活罐等重要設備的驗證或者校驗對布病活疫苗生產、檢驗中使用的生物安全柜、獨立通過隔離器以及活毒廢水滅活罐的無害化處理等都需要進行驗證或者校驗。一般，生物安全柜1年校驗一次，使用中隨時注意吸入風速與垂直風速。必須使用負壓獨立通風隔離器(IVC)，確保檢驗人員的安全。對IVC鼠籠原位消毒后，才能移動到清潔區外。確認對滅活罐體內維持的溫度及其持續時間，對溫度表及其壓力計進行定期驗證，確保其滅菌效果。

2.1.6 注意正壓呼吸頭套等個人防護設備的正確使用與維護 根據布魯氏菌感染人員的途徑與感染形式的不同，在整個生產、檢驗等涉及活菌操作的人員防護中就需要針對性做好個人防護。在涉及到大量布魯氏菌的繁殖、分裝過程中，生產車間內的工作人員應該佩戴正壓呼吸頭套，結束后應及時對正壓呼吸頭套進行消毒以防止交叉污染。一般常用的0.2%苯扎溴銨溶液、0.1%聚維酮碘溶液、戊二醛、癸甲溴銨、0.1%聚維酮碘溶液[7-8]或者75%酒精溶液滅菌效果較好。此外，最好能將正壓呼吸頭套置入密閉熏蒸柜內熏蒸消毒，以徹底殺滅內外表面殘留的微量病原微生物。

2.2 加強對生產工藝、關鍵參數的控制及消毒滅菌的驗證

2.2.1 加強對生產工藝審批備案等管理，對關鍵參數進行驗證 2020年版《獸藥GMP規范》規定[4]，企業自己經過驗證后制定的布病活疫苗生產工藝一旦審批通過，就不能輕易變更。如需變更，必須經過驗證和生物安全風險評估，證明其對產品質量不會產生不良影響，且不會產生生物安全風險，將變更后的工藝到原審批單位進行備案。因此，布病活疫苗生產企業一定嚴格按照農業農村部審批的生產工藝規程[9-10]制定經過自己驗證的生產工藝，并嚴格按照申報審批的工藝規程進行生產與檢驗。

2.2.2 做好潔凈區域潔凈級別的監測 2020年版《獸藥GMP規范》規定應該對無菌生產過程進行動態檢測，可以采用測定沉降菌和浮游菌的方式進行。一旦超標，就要對分離培養的細菌進行是否為布魯氏菌鑒定，以及時發現生物安全風險，降低人員感染風險。由于單個沉降平皿需要暴露4 h[5]，普通的培養基常因表面干裂影響分離效果，產生假陰性結果。為此，也可以采用同一位置使用多個平皿連續進行監測并累積計數的方法進行檢測。對于操作活菌區域的人員還要進行隔離服及手套等部位擦拭檢測含菌量，以驗證車間動態潔凈級別。

2.2.3 消毒及驗證工作 消毒及消毒效果驗證主要根據布魯氏菌的生物學特性及其對物理、化學等因素的抵抗力決定。根據布魯氏菌對濕熱的敏感性選擇濕熱滅菌對發酵罐進行消毒，采用高壓滅菌對重復使用的衣物及耐高壓的物品進行滅菌處理，采用擦拭消毒劑對操作臺面進行消毒處理，采用氣體熏蒸對密閉空間內滅菌消毒。不同消毒滅菌的方法也需要采用適宜的驗證方法，對環境溫度、溶液溫度、消毒劑濃度/霧滴大小、作用時間、壓力等重要參數對最終消毒效果的影響因素。

2.3 加強對相關人員的培訓及應急演練 布魯氏菌主要傳染途徑為消化道、眼結膜、破損的皮膚、呼吸道等途徑[11]。所以，布病疫苗生產、檢驗及設施維護的人員要經過必要的專業知識培訓，重點對正壓呼吸頭套、乳膠手套、N95口罩等個人防護設備設施正確使用的培訓以及正確配制消毒液與正確消毒操作及的培訓。對密閉空間消毒時人員防護，布魯氏菌泄露或者操作活菌人員出現利器刺傷時應急演練應該成為檢驗培訓效果常態。

3 結 語

本文僅就布病疫苗生產、檢驗、維護中主要的生物安全風險點進行分析與梳理。在整個布病活疫苗生產過程中還有很多其他的風險點往往容易被大家忽視。因此，需要不斷提高認識，杜絕在布病疫苗生產、檢驗中出現的泄露誤判或者漏檢等風險。

就布病疫苗生產企業而言，還需要對生產車間內外環境進行檢測。在車間內，同時動態檢測沉降菌[12]、浮游菌[13]、懸浮粒子[14]。在車間外，定期在周邊樹葉、地面等環境采樣，分析散毒風險，并對相關人員進行抗體檢測。根據2020年版《獸藥GMP規范》附錄3[5]第15條和第24條的規定，布病疫苗生產區域可以根據風險評估的結果采用絕對負壓或者相對負壓，以確保生物安全風險。實際上，對車間生產狀態下進行負壓控制受很多因素影響[15]，比如在開門與閉門，不同區域功能壓力波動瞬間干擾，送排風機機啟動與關閉造成氣流分配紊亂等也會存在一定影響，需要對變頻調節風速與風量系統進行驗證與風險評估。

隨著我國的布病疫苗生產企業的生物安全風險認識及控制水平不斷提升，布病疫苗的質量管理水平必然得到進一步的提高。只有不斷加強布病活疫苗生產工藝重要參數的驗證，對生產檢驗各個環節制定詳細的操作規程及其風險防控預案，才能持續提升獸藥生產企業生物安全管控能力。