中國山羊痘弱毒疫苗AV41株基因組分子標記的比較分析

陸 游，南文龍，鞏明霞，李 林，鄒艷麗，吳曉東，彭大新，陳義平*

(1. 揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009；2. 中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032)

牛結節性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)是一種由羊痘病毒屬牛結節性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus, LSDV)引發的急性、亞急性傳染病[1]。該病臨床表現為皮膚水腫及局部堅硬的結節、結痂或潰瘍，懷孕牛流產，奶牛產奶量減少，公牛暫時或永久不育，商品牛的肉質或皮張利用率明顯下降[2-3]。2019年8月，LSD疫情首次發生于我國新疆伊犁州，2020年6月以來，我國福建長汀、江西贛州、廣東潮州、安徽黃山、浙江金華等地又確診發生該疫情[4]。世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定報告的動物疫病，農業農村部暫時將其作為二類動物疫病管理。

根據《牛結節性皮膚病防治技術規范》，我國采用山羊痘弱毒疫苗AV41株，按山羊的五倍劑量免疫牛來預防LSD[5]。但弱毒疫苗的使用可對LSDV野毒的診斷和監測產生干擾[6-7]。當前尚無AV41株的特異性鑒別檢測方法，本研究擬篩選、驗證AV41株基因組獨特性分子標記，為該疫苗株與我國LSDV野毒株的鑒別提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 毒株 山羊痘弱毒疫苗AV41株購自哈藥集團生物疫苗有限公司、山東綠都生物科技有限公司，山羊痘病毒+小反芻獸疫病毒二聯弱毒疫苗(AV41株+Clone 9株)購自華派生物工程集團有限公司。中國LSDV野毒株LSDV/China/XJ2019-1由中國動物衛生與流行病學中心分離鑒定。

1.2 試劑與儀器 磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR擴增試劑2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)購自Vazyme公司，毛細管電泳儀及DNA Marker購自QIAGEN公司，引物由睿博興科(青島)有限公司合成。

1.3 病毒核酸提取 采用磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，提取中國LSDV野毒株和不同廠家來源的山羊痘弱毒疫苗AV41株的基因組DNA，廠家代號為A、B、C。

1.4 基因組分子標記篩選 從GenBank中下載已有的全部27 株LSDV基因組全序列(GenBank登錄號：MN995838.1、MT130502.1、MN642592.1、MN072619.1、KX894508.1、MH893760.2、KY829023.3、KY702007.1、KX683219.1、MT134042.1、MT643825.1、AF325528.1、AF409137.1、MH646674.1、MT992618.1、MN636843.1、MN636841.1、MN636840.1、MN636839.1、MN636838.1、MK4418381、MG972412.1、KX764645.1、KX764644.1、KX764643.1、AF409138.1、MT134042.1)，除AV41株以外全部11 株GTPV基因組全序列(GenBank登錄號：MN072621.1、KC951854.1、MN072625.1、MN072624.1、MN072623.1、MN072623.1、MN072620.1、KX576657.1、MW020570.1、AY077836.1、AY077835.1)和全部的12 株綿羊痘病毒(Sheep poxvirus，SPPV)基因組全序列(GenBank登錄號：MN072631.1、MN072630.1、MN072629.1、MN072628.1、MN072627.1、MN072626.1、MW020571.1、AY077834.1、AY077833.1、AY077832.1、KT438551.1、KT438550.1)。利用生物信息學軟件BLAST和DNAstar，將AV41株基因組全序列(GenBank登錄號：MH381810.1)逐段與上述LSDV、GTPV、SPPV基因組全序列進行比較，分析篩選AV41株基因組分子標記。

1.5 測序驗證 于1.4篩選的AV41株分子標記所在的基因兩側序列設計引物，采用1.3方法制備的DNA模板進行PCR擴增，對擴增產物測序，驗證不同來源的AV41株相關分子標記位置的基因組序列，并與我國LSDV 野毒株基因相比較，確認AV41株基因組獨特分子標記存在及分布情況。

反應體系25 μL：2×Vazyme Taq Plus Master Mix(Dye Plus)12.5 μL，上下游引物(5 μmol/L)各1 μL，核酸模板2 μL，無核酸酶水8.5 μL。

反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環；72 ℃最后延伸6 min。PCR 反應結束，利用毛細管電泳儀分析結果，PCR 產物送睿博興科(青島)有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 基因組分子標記篩選 將AV41株基因組全序列與GenBank 數據庫下載中的27株LSDV、11株GTPV、12株SPPV基因組全序列進行比較，共篩選獲得19個AV41 株分子標記，包含4個插入標記，4個缺失標記和11個單核苷酸多態性(SNP)標記(表1)，而其余LSDV、GTPV、SPPV毒株基因組全序列對比結果中，尚未發現上述19個標記。根據分子標記所在基因兩側序列設計引物(表2)，其中，EEV maturation protein基因采用兩組引物擴增，一組用于G2261T位點測序，另一組用于2285C2286與ΔC2293-2294兩個位點測序。IL-1R基因的C582A和T571G位點采用同一組引物進行擴增測序。

表2 AV41 分子標記測序驗證用PCR 引物Tab 2 PCR primers for molecular marker sequencing verification of AV41

2.2 測序驗證 以中國LSDV野毒株和不同廠家生產的AV41株的基因組DNA為模板，對2.1中19個分子標記所在位置相應基因進行PCR擴增，毛細管電泳顯示，擴增基因目的條帶均與預期大小相符(圖1)。經測序驗證，并與LSDV野毒株基因組相關位置序列相比，其中7個為AV41基因組獨有的分子標記，包括2個插入標記(DNA ligase基因2433A2434、Kelch-like protein基因1831A1832)和5個SNP位點標記(GTPV_gp020基因G203A、GTPV_gp021基因C681T、DNA-binding viron core protein基因C47T、RNA polymerase subunit 基因T64C和Myristylated protein基因C746A)，具體見表1與圖2。

1：15-3000bp Marker；2：GTPV_gp001 gene；3：IL-1R gene；4：EEV maturation protein gene (G2261T)；5：GTPV_gp058 gene;6：GTPV_gp066gene；7：Virion core protein gene；8：DNA ligase gene；9：GTPV_gp021 gene；10：GTPV_gp020 gene；11：DNA-binding viron core protein gene；12：EEV maturation protein gene (2285C2286+ΔC2293～2294)；13：RNA polymerase subunit gene；14：Myristylated protein gene；15：TK gene；16：RING finger host range protein gene；17：Kelch-like protein gene；18：Ankyrin-like 圖1 AV41分子標記所在基因PCR擴增結果Fig 1 PCR amplification of marker genes of AV41

NCBI AV41、NCBI 27 LSDVs、NCBI 11 GTPVs、NCBI 12 SPPVs：NCBI數據庫中的1株AV41、27株LSDV、除AV41外的11株GTPV、12株SPPV序列；A-AV41、B-AV41、C-AV41：不同廠家生產的AV41；WT-LSDV：中國LSDV野毒株；方框所示堿基為差異堿基；“-”：表示該處堿基缺失NCBI AV41, NCBI 27 LSDVs, NCBI 11 GTPVs, NCBI 12 SPPVs：1 strain of AV41, 27 strains of LSDV, 11 strains of GTPV except for AV41 and 12 strains of SPPV in NCBI database; A- AV41, B- AV41 and C-AV41：AV41 strains produced by different manufacturers；WT-LSDV：wild-type LSDV in China. The bases shown in the box are different bases；"-"：base deletion圖2 AV41 7個獨特分子標記所在基因序列對比Fig 2 Sequence comparison of seven specific molecular markers for AV41

3 討論與結論

牛結節性皮膚病病毒與山羊痘病毒、綿羊痘病毒同為羊痘病毒屬成員，相互間基因組全序列同源性高達95%[8]，編碼主要抗原的基因序列相近。因此，采用同屬同源或異源弱毒疫苗株進行免疫，都可預防牛結節性皮膚病。國際上用于LSD免疫的同源疫苗株有Neethling株與0240/KS-1株，異源疫苗株有SPPV RM65株與Romanian株，GTPV_Mysore株與Gorgan株等。非洲、中東、巴爾干等LSD流行地區的防控經驗顯示，采用弱毒疫苗免疫有效控制了該病的傳播擴散[9-10]。

分子生物學方法是鑒別野毒株與疫苗株的主要手段，如熒光探針法和高分辨率熔解峰分析法(High-resolution melting,HRM)等。Eirini等根據Neethling株在G蛋白偶聯趨化因子受體基因處插入的12 bp堿基，設計了雙重探針的熒光定量PCR方法，可以區分Neethling_vaccine_LW疫苗株和LSDV_Turkey_2014等9種LSDV野毒株[11]。Tesfaye等基于SPPV疫苗株在B22R同源基因存在的21 bp與27 bp堿基缺失，建立了HRM分析法，可用于SPPV Romanian疫苗株等4種SPPV疫苗株與LSDV_Evros/GR/15等4種LSDV野毒株的鑒別[12- 13]。當前，我國尚未開發或從國外引進LSDV同源疫苗株。山羊痘弱毒疫苗AV41株可用于免疫山羊和綿羊預防GTPV與SPPV，已有近35年使用經歷，證實其安全有效[14-15]。該疫苗株也可作為我國預防LSD的異源弱毒疫苗使用。鑒別診斷方面，聶福平等基于LSDV野毒株ORF126區域插入的26 bp堿基，建立了檢測LSDV野毒株的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法，僅特異性擴增LSDV野毒株相關基因，而對異源疫苗AV41株無擴增信號[16]。

目前，國內尚無直接鑒別檢測AV41株的方法。本研究將AV41株基因組全序列與GenBank中的LSDV、GTPV和SPPV毒株序列比較，對中國LSDV野毒株和不同廠家生產的AV41株相關基因測序，證實其中7 個分子標記為AV41株獨特性，包括DNA ligase基因2433A2434、Kelch-like protein基因1831A1832、GTPV_gp020基因G203A、GTPV_gp021基因C681T、DNA-binding viron core protein基因C47T、RNA polymerase subunit基因T64C、Myristylated protein基因C746A。上述結果顯示，所選分子標記可用于我國山羊痘弱毒AV41株和LSDV野毒株的病原鑒別，即對分子標記位置采用直接測序的方法，可鑒定為疫苗株或野毒株；或基于分子標記中的SNP位點，開發可用于區分相關SNP位點的熒光定量PCR方法；或基于插入位點，建立可區分野毒株與疫苗株不同熔解曲線峰圖的高分辨率熔解峰分析法等。本研究可為我國LSD防控工作提供技術支持，也可進一步為山羊痘弱毒AV41株與國內山羊痘病毒、綿羊痘病毒野毒株的鑒別提供參考。