植物病原真菌尖孢鐮刀菌檢測與定量研究進展

董 超， 方香玲

(草地農業生態系統國家重點實驗室， 農業農村部草牧業創新重點實驗室， 蘭州大學草地農業科技學院， 甘肅 蘭州 730020)

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是一種土傳病原真菌，能引起植物枯萎病和根腐病[1]。該菌能侵染芭蕉科植物如香蕉(Musanana)、薔薇科植物如草莓(Fragariaananassa)、葫蘆科植物如西瓜(Citrulluslanatus)、十字花科植物如甘藍(Brassicaoleracea)、茄科植物如番茄(Lycopersiconesculentum)和豆科植物如苜蓿(Medicagosativa)等100多種具有重要經濟價值的作物[2-3]。尖孢鐮刀菌在植株根部維管束中定殖，導致導管堵塞，地上部分枯萎，根表皮產生褐色壞死斑，后期根部腐爛甚至整株植株死亡，嚴重影響植物的生長發育、產量以及品質[4-8]。尖孢鐮刀菌侵染后會造成作物大面積的減產，如會引起西瓜減產20%～30%，嚴重田塊可達50%～60%，甚至絕產；發病香蕉園病株率10%～40%，嚴重可達90%以上以至香蕉園荒棄；苜蓿被感染后產量下降20%～40%，嚴重地塊下降60%以上[9-12]。

目前關于尖孢鐮刀菌的研究主要集中在其對植物生長的影響、致病性相關基因表達、防治方法以及不同植物對尖孢鐮刀菌的抗病性和抗病機制等方面[13-16]，對尖孢鐮刀菌的定性檢測和定量分析是進行這些研究的基礎。由于尖孢鐮刀菌是土傳病原菌，土壤中的尖孢鐮刀菌含量與病害的發生和嚴重程度相關。根際土壤是植物根周圍土壤的微域環境，是在理化性質、生物特性上不同于原土體的特殊區域，根際土中尖孢鐮刀菌含量更直接關系到病害的發生和嚴重程度[17]。植物組織內的尖孢鐮刀菌含量，與尖孢鐮刀菌的侵染程度相關。對植物根組織和土壤中的尖孢鐮刀菌進行檢測和定量，有助于監測田間病害的發生，從而減小經濟損失。本文對培養基菌落平板稀釋法、常規PCR以及實時熒光定量PCR等檢測和定量尖孢鐮刀菌的方法及應用進行總結，以期為農業生產中尖孢鐮刀菌檢測和定量提供理論依據。

1 培養基菌落平板稀釋法

尖孢鐮刀菌研究初期是采用培養基菌落平板稀釋法進行定性和定量分析的。根據尖孢鐮刀菌對營養元素的需求，使用添加抗生素的天然培養基或選擇性培養基培養分離，分離出尖孢鐮刀菌后進行培養，純培養后觀察其形態特征生長習性以及顯微結構，使用稀釋平板法對其進行定量。常用的尖孢鐮刀菌選擇性培養基有馬鈴薯酒精瓊脂培養基(Potato ethanol agar medium,PEA)[18-19]和Komada培養基[20-22]等。PEA培養基是韓寶坤等結合馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(Potato sucrose agar medium,PSA)和酒精瓊脂培養基(Ethanol agar medium,EA)，通過降低碳源，尋找新的抑菌物質研制出的尖孢鐮刀菌選擇性培養基，其優點是制作材料便宜，接種時無需無菌操作[18]。而Komada培養基是使用較為廣泛的尖孢鐮刀菌選擇性培養基，在香蕉、西瓜、蘆葦和三七等多種作物枯萎病的研究中均有使用[20-22]。

稀釋平板法是定量尖孢鐮刀菌十分常用的方法，其優點是能夠檢測出活菌的數量，培養基成本低且操作簡單，已應用于多種植物以及土壤中尖孢鐮刀菌的檢測[23]。目前已有研究者對尖孢鐮刀菌西瓜?；驮诟H土和非根際土中的含量進行了稀釋平板定量分析，發現單作西瓜根際土中尖孢鐮刀菌含量高于根圍土[24]。何欣等通過對香蕉枯萎病植株根際土和非根際土中尖孢鐮刀菌進行稀釋平板定量分析，發現根際土中的尖孢鐮刀菌含量與根圍土中尖孢鐮刀菌含量的比值越大，香蕉枯萎病發病越嚴重[11]。但由于培養基菌落平板稀釋法實驗周期較長，效率和靈敏度較低，現多與分子方法結合進行驗證實驗，例如盛茹媛結合傳統方法與分子方法定量檢測了草莓根中的尖孢鐮刀菌[25]。

2 分子檢測定量方法

2.1 常規PCR

自PCR技術問世以來，就因其靈敏、快速和準確等諸多優點被廣泛應用于植物病原真菌的檢測[26-27]。來自同一物種的分離物序列相同，而物種發育越多樣化，序列差異也越大[28-29]，由于核糖體DNA的編碼區序列具有保守性，因此分析真菌核糖體DNA的編碼區序列是真菌分類鑒定的有效方法[30]。

PCR檢測技術多樣，根據不同引物的PCR檢測技術有ITS-PCR和SCAR-PCR，而在PCR基礎上進行改進的技術有PCR-ELISA、巢式PCR和多重PCR等[31]。Amutha等在檢測引起洋蔥枯萎病病原物時，利用ITS通用引物ITS1進行PCR擴增，擴增產物顯示與尖孢鐮刀菌100%同源，同時根據其形態特征進行鑒定，鑒定其為尖孢鐮刀菌[32]。除根據ITS序列進行PCR測定，還可以使用特定序列擴增。限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)就是通過擴增特定序列來檢測尖孢鐮刀菌的方法，此方法在短時間內即可檢測出植物組織和土壤中的尖孢鐮刀菌[33]。而莫賤友等使用兩種引物檢測發生枯萎病的香蕉根組織，對于分離出的6株菌株，使用ITS特異引物(對尖孢鐮刀菌不同?；途陻U增出547 bp的片段)和SCAR特異引物(對尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種擴增出252 bp的片段，對尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種擴增出205 bp的片段)進行PCR檢測，發現1株為尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種，其余均為尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種，說明常規PCR可以根據不同引物檢測出不同病原菌[34]。而PCR-RFLP和巢氏PCR可以在侵染初期和潛育期檢測出尖孢鐮刀菌，對早期診斷具有較大幫助[35]，研究表明PCR-RFLP可以在感病品種接種后3天檢測到病原菌，巢式PCR可在接種后5天檢測到尖孢鐮刀菌[36]。除PCR-RFLP之外，在常規PCR的基礎上，還開發了多重PCR檢測技術，可在一次PCR反應中同時檢測多種目標病原體?，F已有研究者設計了針對黃瓜枯萎病病原體的新穎和簡化引物對，并開發了可同時檢測5個目標病原體的多重PCR分析法，從而能夠快速準確地診斷相應的病害[37]；Hyun等開發的PCR檢測方法可以鑒定四種隔離的真菌病原體[38]。

常規PCR已經成為診斷和研究尖孢鐮刀菌的主要工具。PCR技術較傳統的研究方法具備許多優勢，例如：無需進行尖孢鐮刀菌的培養，可以在復雜混合物中檢測單個目標微生物，具有快速、靈敏、特異等特性，但常規PCR不能進行尖孢鐮刀菌的定量分析[39]。

2.2 實時熒光定量PCR法

由于目前對病原菌的研究不僅需要定性分析，更需要對其精確定量，實時熒光定量PCR(簡稱實時PCR)開始應用于植物病原菌的檢測和定量中。常規PCR檢測方法為終點檢測法，因為這種檢測方法PCR擴增過了對數期，所以重復性較差[40]。而實時PCR在熒光能量傳遞的基礎上，通過一種可以嵌入雙鏈核酸2層堿基之間的熒光染料，在紫外光的激發下，通過測定PCR反應退火或延伸階段所摻入熒光染料的熒光強度，實現對整個PCR循環進程的實時監控，可以根據循環數與熒光強度的對應關系對待測物進行精確定量，從而可以準確可靠地定量根組織和土壤中的尖孢鐮刀菌[39]。

通過實時PCR分別對天然感染的植物組織和土壤以及人工感染土壤中尖孢鐮刀菌進行定量分析[40]發現，人工接種的濃度與檢測到的尖孢鐮刀菌DNA濃度具有線性關系。此外，由于此試驗在多種樣品(大豆、西瓜和鷹嘴豆的根和自然感染的土壤等)中仍完成了尖孢鐮刀菌的準確定量，說明其改進的實時PCR方法的敏感性不受樣品的影響。在使用實時PCR檢測和定量黃瓜中尖孢鐮刀菌黃瓜?；偷倪^程中，發現了實時PCR分析的擴增效率、靈敏度和可重復性不受樣品中其他微生物DNA的影響[41]。使用實時PCR對人工感染的尖孢鐮刀菌土壤和自然發病地塊的土壤進行了尖孢鐮刀菌定量，檢測出田間收集的番茄地土壤中的尖孢鐮刀菌含量范圍為35～182 pg·g-1干土，并且與田間枯萎病的病情指數呈正相關[42]。

土壤中的生物環境和生化環境的改變都會對尖孢鐮刀菌含量產生一定程度的影響。使用實時PCR對連續種植香草超過20年但枯萎病的發病率相差7倍的果園中的尖孢鐮刀菌進行定量，結果表明在細菌及真菌豐富的土壤環境中依舊可以準確定量尖孢鐮刀菌，發病率高的地塊尖孢鐮刀菌量是發病率低的地塊的1.9倍，說明實時PCR可以在微生物類別復雜的土壤環境中準確地定量尖孢鐮刀菌[43]。而Li等人的研究則表明實時PCR可以在AM真菌豐富的土壤環境中對尖孢鐮刀菌進行準確地定量，發現根際土中尖孢鐮刀菌數量受AM真菌的影響較小，但根中尖孢鐮刀菌在接種AM真菌后顯著降低且與草莓的病情指數呈正相關關系[44]。除此之外，還有研究者使用實時PCR分析土壤理化性質對尖孢鐮刀菌含量的影響，例如使用實時PCR來分析草莓枯萎病樣地的土壤中的尖孢鐮刀菌含量的過程中發現，使用土壤改良劑后尖孢鐮刀菌含量由2 000 CFU·g-1干燥土壤降低到0[45]。使用實時PCR對氮含量不同的西瓜根際土和土體土中的尖孢鐮刀菌進行定量分析時，發現了氮素的添加能有效地抑制西瓜根際土中尖孢鐮刀菌，使每克土壤尖孢鐮刀菌的拷貝數由8.9×105降低到6.6×103個[46]。

對植物組織中的尖孢鐮刀菌定量有助于對尖孢鐮刀菌在植物體內的作用部位進行研究，并以此來探索其作用機理。有研究者使用優化的實時PCR對香蕉假莖、球莖和根組織中的尖孢鐮刀菌進行定量分析，發現他們優化的體系的檢測限為0.001 ng DNA[47]。使用實時PCR對不同品種菜豆根系中尖孢鐮刀菌進行定量以篩選抗病的菜豆品種，發現該技術對根、莖組織中的尖孢鐮刀菌DNA最低檢測量為1pg[48]。

常規PCR中，反應結果常受反應物中的一些化合物抑制，因為它們會影響PCR產物的積累，但實時PCR的試驗結果并不依賴于產物積累，而是通過早期階段熒光信號的產生來實現的，因此實時PCR可以在復雜的樣品中進行尖孢鐮刀菌的定量[49]。

3 其他檢測定量方法

3.1 免疫學檢測

免疫學檢測法主要研究抗原和抗體的特異性反應，是一種出現較早應用廣泛的實驗技術。先是在醫學和動物醫學方面廣泛應用，而后也被應用于植物病害檢測[25]。酶聯免疫吸附法(ELISA)是根據抗原抗體特異性反應將待測物與酶連接，通過酶的高效催化作用與底物發生顯色反應，從而對受檢測物質進行定性定量分析，是最早應用的免疫學檢測手段[50]。有研究使用ELISA法定量香蕉根系中的尖孢鐮刀菌，證實了使用生物防治劑后香蕉根組織中的尖孢鐮刀菌的含量減少[51]。并且，使用ELIST和常規PCR方法鑒定鐮刀菌，發現ELISA得出的結果與ITS測序鑒定結果100%一致，說明ELISA檢測菌種是一種可靠的方式[52]。但ELISA法需提取血清純化，不同寄主抗原抗體不同，不能標準化，導致其在檢測尖孢鐮刀菌方面使用受限。

3.2 基因宏陣列

基因宏陣列，是一種運用于醫學上檢測基因病變的分子生物學方法，經過改進已有效地運用于人、動物以及植物病原菌的檢測?；蚝觋嚵惺菍o數個核酸序列探針固定在尼龍纖維膜上，通過與標記了發光物質的產物雜交產生信號的一種檢測方法[53]，是目前最適合在一次檢測中檢測多種病原體的技術[26]?；蚝觋嚵信c實時熒光定量PCR對同樣處理的樣品進行檢測，雖然未能定量出尖孢鐮刀菌，但代表雜交信號強弱的灰度值與實時熒光定量PCR的結果正相關，尖孢鐮刀菌含量越高，雜交信號越強[46]。因此在分析尖孢鐮刀菌變化趨勢及病害的嚴重程度時，基因宏陣列也是一個選擇。

4 不同方法的綜合運用及其比較

目前關于尖孢鐮刀菌的檢測和定量多是結合傳統和分子生物技術進行的。劉芮池等使用多重PCR對菜地土壤的尖孢鐮刀菌進行檢測，同時也使用形態學方法對菜地土壤病原菌進行鑒定[54]。除此之外由于香蕉枯萎病病原菌的生理小種較難鑒定，對其尖孢鐮刀菌的檢測也采用形態學鑒定與PCR相輔相成的方式[55-56]。兩種方法結合也用于苜蓿、甘藍、仙人掌以及它們的種植土壤的尖孢鐮刀菌檢測[38,58]。形態學鑒定雖耗時費力，但其結果直觀，可以與PCR結果相互印證，提高說服力。ELISA和PCR技術結合可以提高檢測的靈敏度[52,59]。。常規PCR定性分析，實時熒光定量PCR定量分析被使用在香蕉枯萎病的研究中[47]，常規PCR可以簡便地檢測出尖孢鐮刀菌的存在，得出結果后再使用實時PCR定量可以減少繁雜的操作，節約成本。在研究菠菜枯萎病時，使用實時熒光定量PCR對其尖孢鐮刀菌的定量與使用稀釋平板法對尖孢鐮刀菌定量結果呈顯著正相關[60]。采用多種方法檢測可以對結果進行驗證，得到更加準確的結果。

培養基菌落平板稀釋法是經典的檢測方法，經過長時間的摸索具有完整的工作方法和普遍性，并且能夠檢測出活菌的數量，培養基準備成本低，過程簡單。但此方法經驗性較強，實驗周期長，需要進行一定程度的摸索后才能提高效率。但隨著分子生物學的發展，PCR技術彌補了其缺點，常規PCR技術檢測快速靈敏、準確性高、效率高，盡管不能進行定量分析，但仍然是定性分析的良好選擇。而實時熒光定量PCR則可以進行準確地定量分析，具有高效準確、特異性強等優點，是目前進行尖孢鐮刀菌檢測和定量的最佳選擇。并且隨著生物技術的快速發展，成本降低后實時PCR將成為大規模檢測和定量尖孢鐮刀菌的方法。目前已有多種檢測技術用于檢測尖孢鐮刀菌，我們在使用時，可以根據我們的實際需求進行選擇。

5 結語與展望

隨著生物技術的發展，新的檢測技術如生物芯片、全基因組測序等方法在真菌檢測領域也有所應用。通過綜合運用培養基菌落平板稀釋法、常規PCR和實時熒光定量PCR、以及新的技術方法，可對不同植物組織和不同生境土壤中尖孢鐮刀菌進行有效地檢測和定量，從而為預防病害的發生、流行及其有效防治提供前期依據。