生物制品中內毒素的危害及其去除方法的研究進展

李生軍， 張海霞， 馮若飛*

(1.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

在生物制劑生產過程中由于不可避免的細菌污染，導致革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)成分殘留于生物制劑中，這種脂多糖是由革蘭氏陰性菌死亡或分解后釋放的，又稱內毒素[1]。革蘭氏陰性菌中最具代表的大腸桿菌由于其具有轉化效率高、重組蛋白產率高、易于控制和易于放大等優點，因此，被廣泛應用于重組蛋白的表達[2]。然而，大腸桿菌表達的重組蛋白在純化過程中同時伴隨著內毒素的殘留，由于機體對殘留的LPS有免疫識別作用，在機體內作用于單核巨噬細胞并產生多種細胞因子，適量的細胞因子可激活免疫系統，對機體有益，而過量則可引起機體嚴重的病理反應，輕微時表現為發熱、休克、心率過快，嚴重時生物制劑中殘存的LPS經血液引起致命性敗血癥，并伴有多器官功能衰竭甚至死亡[3-4]；每年全世界有超過500萬人死于敗血癥，敗血癥的治療已成為現代醫學的一個嚴峻挑戰，細菌來源的生物制劑從本質上限制了其在人類和其他哺乳動物中的使用[5]。因此，必須對生物制品中的內毒素進行去除或使其達到藥品規定的內毒素含量標準后方可使用[5]。目前報道去除內毒素方法根據作用方式主要有超濾法、活性炭吸附法、親和吸附法、離子交換層析等。

1 內毒素的結構特征

LPS是革蘭氏陰性菌細胞膜上的主要結構成分，包被約四分之三的外膜，LPS由多糖O抗原(O-PS)、核心多糖(C-OS)和類脂A(Lipid A)構成[6]。O-PS由2～6個寡聚糖組成，是LPS中最容易發生變異的部分，由于細菌種類不同所以多糖O-PS組成亦不同；C-OS主要的作用是連接類脂A和O-PS，由己糖、庚糖、2-酮基-3-脫氧辛酸等組成[7]。類脂A是LPS中最小的結構單位，也是最為保守的部分，同時也是LPS的活性中心，決定著細菌的致病性，其成分是由氨基葡萄糖雙糖構成的親水性骨架和疏水性脂肪酸鏈組成的磷脂[6]。迄今為止，多種細菌類脂A的化學結構已被測定，主要不同之處在于脂肪酸和磷酸基團的差異[8]。

脂類A作為LPS生物活性的主要集中部分，通過與靶細胞的受體蛋白分子相互作用，激活復雜的信號通路，最終導致機體發生一系列病理反應，類脂A過度刺激天然免疫會導致器官損傷，嚴重休克，甚至可能會導致哺乳動物和人類死亡[9]。

2 內毒素與外毒素的區別

內毒素由革蘭氏陰性菌產生，其主要成分是脂多糖，具有很強的耐高溫屬性，250 ℃高干熱滅菌才能破壞其生物活性，故難以徹底清除[10]。在細菌入侵機體時沒有組織器官的選擇性，內毒素會因細菌種類的不同存在或多或少的差異，但是致病后的臨床癥狀卻大同小異，主要表現為腹瀉、發熱、敗血癥等[11]。外毒素主要是由革蘭氏陽性菌產生，例如破傷風梭菌、白喉棒狀桿菌、肉毒梭菌，部分革蘭氏陰性菌也可產生，如產毒性大腸桿菌，以及霍亂弧菌等[12]。其主要成分是蛋白質，因此，對化學物質和熱原很敏感，極易喪失生物活性，用3%～4%的甲醛溶液處理其毒性可完全消失，但是其抗原性較強，可誘使機體產生抗毒素[13]。

3 內毒素的致病性

3.1 發熱反應

人體對LPS極為敏感，極微量內毒素就能引起體溫上升，這主要與脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)、白細胞分化抗原(CD14)所介導的反應有著密切的關聯。當機體受到細菌感染后，LPS與LBP結合，并與LPS的受體CD14形成LBP-LPS-CD14復合體，由于CD14沒有胞內結構，同時也沒有蛋白酶水解活性，導致CD14無法單獨將胞外信號傳遞至胞內，此時Toll樣受體4就承擔起跨膜信號傳導的重任[14-15]。LBP-LPS-CD14復合體激活TRL14，TRL14與Toll/interleukin-1 receptor(TIR)區域相互作用，激活髓性分化因子88(MyD88)、IL-1R相關的激酶(IRAK)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)，這些相關因子分別被磷酸化后向細胞核內移位并作用于相應的轉錄因子，從而啟動核內基因表達，激發LPS刺激所介導的細胞反應，致使細胞分泌大量的TNF-α、IL-6以及IL-1，最終刺激免疫系統抵抗入侵的細菌和引發炎癥反應，這些細胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調節中樞，促使體溫升高發熱[16-19]。

3.2 內毒素休克

當機體中侵入大量革蘭陰性病原菌并死亡時，會在機體中釋放大量LPS進入血液，使機體發生內毒素血癥。而這些機體中的內毒素作用于巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞、血小板以及補體系統和凝血系統等，并產生IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α、組胺、前列腺素、激肽等生物活性物質。這些物質作用于小血管臨床表現為微循環衰竭、低血壓、缺氧、酸中毒等功能紊亂而導致微循環障礙，這種病理反應叫做內毒素休克[20]。當機體接受有效的治療后，會導致細菌大量死亡崩解，進一步導致血液中內毒素升高，并加重內毒素血癥。大量的動物實驗及臨床實踐表明，內毒素可造成人及動物多系統的多種疾病，其中包括肺損傷、肝損傷、腸損傷、腎損傷及彌漫性血管內凝血、感染性休克、酸中毒及全身多功能臟器衰竭[21]。

4 內毒素的去除方法

4.1 超濾法

隨著膜分離技術的迅猛發展，在生物制藥中利用物質分子大小去除內毒素的超濾法越來越受研究者的青睞。羅濛[22]利用截留相對分子質量為30萬的超濾膜對狂犬病疫苗進行濃縮超濾，內毒素檢測結果顯示，去除效率可達87.5%～98.7%。李村玉等[23]采用截留相對分子質量10×103的超濾膜對甘草酸中的內毒素進行超濾，并以超聲進行輔助，實驗結果顯示，內毒素去除率可達93.7%，超聲后的甘草酸的透過率可達92.3%，有效的提高了制劑的安全性。超濾法是基于分子量的大小去除內毒素，適用于水溶液和小分子溶液去除內毒素，在蛋白質等大分子物質使用超濾法會導致有效分子大量流失。

4.2 吸附法

4.2.1 活性炭吸附法

活性炭由于其表面積大、吸附能力強、價格低廉、操作簡易等優點，被廣泛的用于內毒素去除，最適用于去除低分子量疏水性內毒素，在微酸性條件下去除效果最佳。李淼等[24]采用活性炭吸附研究熱毒寧注射液中細菌內毒素去除效果，實驗結果表明，活性炭對內毒素吸附率為78.7%，能夠有效的截留細菌內毒素，提高了熱毒寧注射液的安全性。孔祥文等[25]以活性炭為吸附劑，以牛血清白蛋白、牛血清紅蛋白、溶菌酶溶液為原材料，活性炭的吸附效率分別為33.1、51.1和216.5倍。但是由于活性炭的非選擇性，所以目的蛋白過多損失，且樣品處理后的活性炭不易除去，影響產品的后續使用。

4.2.2 親和吸附法

親和吸附法采用種類繁多的吸附劑，是以瓊脂糖等為基質，通過與內毒素有特異性相互作用的配基偶聯。吸附劑配基帶的正電荷與內毒素磷酸基團之間的離子作用，使得吸附劑對制劑中的內毒素有高度的特異性與選擇性；比較其他方法，在目標蛋白損失最小的情況下，能更有效地去除制劑中的內毒素[5]。Petsch等[26]以聚賴氨酸、多黏菌素和組氨酸為配基的親和膜為材料，研究親和膜對內毒素的吸附去除效果，實驗結果表明，以上配基均有很好的去內毒素效果。Wei等[27-28]研究以脫氧膽酸、聚賴氨酸、聚二甲亞胺以及各種氨基酸為配基的親和吸附劑去除內毒素，實驗表明以上配基所帶的電荷以及配基的極性對吸附內毒素的效果有很大的影響；此外，脫氧膽酸、聚賴氨酸、聚二甲亞胺等聚陽離子配基對去除帶正電荷的內毒素均很有效。

4.3 離子交換層析

根據樣品和內毒素等電點的不同，可以選用不同的陰離子和陽離子交換介質，使內毒素分離的同時達到蛋白純化的目的。姬秋彥等[29]用陰離子交換層析柱Capto Q和Capto adhere去除百日咳和絲狀血凝素中的內毒素，可以達到現行國外聯合疫苗實施的標準，并且純化后的樣品保持較好的活性。肖蘭艷等[30]采用離子交換法去除重組巴西堅果過敏原蛋白Ber e1溶液中的內毒素，去除率為99.99%，內毒素濃度為6.25 EU·mL-1，蛋白回收率為42.8%。徐向榮[31]通過Q Sepharose層析法去除內毒素，重組人血清白蛋白干擾素中的內毒素在介質上的結合力比蛋白質強，所以很難洗脫，用高鹽緩沖液才能洗脫內毒素，最終溶液中內毒素含量降低，同時純度也有所提高。

5 問題與展望

超濾法和活性炭吸附法由于對目標分子是非特異性選擇，所以會導致有效分子流失[32]；活性炭吸附法在樣品處理后活性炭不易除去，影響產品的后續使用；而親和吸附法和離子交換層析對制劑中的內毒素有高度的特異性與選擇性，相比較而言，在目標蛋白損失最小的情況下，能更有效地去除制劑中的內毒素[33]。

內毒素普遍存在于生活中，適量的內毒素可促進細胞因子激活免疫系統，對機體有益，而過量則可引起機體嚴重的病理反應，所以注射制劑中內毒素的檢測和控制顯得尤為重要。除去上述各類研究外，研究人員在細菌內毒素檢查方法方面也傾入了很大的心血，譬如常見的檢測方法主要有家兔法、鱟試劑法、微量凝膠法以及重組C因子法。但是諸多檢測方法也存在或多或少的缺陷，例如家兔法不能定量檢測熱原、使用動物實驗檢測周期長、靈敏度低等，因此，家兔法正在逐步被取代，而微量凝膠法也存在假陽性太高的缺陷[34]。目前鱟試劑法以靈敏度高、操作簡易而最常用，但是隨著環境的惡化以及過度捕殺，中華鱟和圓尾鱟已經成為瀕危生物，所以急需內毒素檢測代替方法進行彌補[12]。相信在眾多研究者的努力下定能力克萬難，為保障生物制劑安全再添濃墨重彩的一筆。