循環腫瘤細胞簇促進血行轉移的分子機制研究

劉 洋，鄭 茜，鄭秀芹，范 輝，陸 茵，王愛云，陳文星

(南京中醫藥大學藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是指從實體惡性腫瘤原發灶或者轉移灶釋放進入外周血液循環的腫瘤細胞，是導致腫瘤轉移及復發的重要因素。腫瘤患者外周血中還存在團簇形式的CTC，稱之為循環腫瘤細胞簇(circulating tumor cells clusters，CTC clusters)。Watanabe等最早在癌癥患者的外周血中證實 CTC clusters 的存在，它是由兩個或者兩個以上的CTC聚集形成。研究發現，CTC clusters 比單個CTC具有更強的轉移能力，其轉移能力比單個CTC高出23-50倍[1]。腫瘤的血行轉移是指腫瘤細胞在侵入血管后隨血液在循環中運行并附著在遠端血管內皮的過程，在整個腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞的血行轉移至關重要，有的腫瘤細胞在腫瘤切除手術之前就發生了血行轉移則很大概率導致腫瘤的復發。因此，探究循環腫瘤細胞簇的形成機制，限制其血行轉移能力或許可以減少腫瘤的復發，并為臨床治療腫瘤轉移提供新的依據。

1 CTC clusters的特征起源

腫瘤細胞在血液循環中的存在形式既有單個腫瘤細胞形式——即循環腫瘤細胞，也有團簇形式——即循環腫瘤細胞簇，而不同的細胞形式所具有的轉移特性及能力也大不相同，CTC clusters屬于單克隆細胞群，以團簇的形式從癌癥病灶脫落進入血液循環[2]。

1.1 CTC clusters的結構特性與單個CTC相比，CTC clusters在循環中運行體積大、速度慢，容易在內臟微血管滯留，CTC clusters的這些物理特性提高了腫瘤細胞在遠處器官發生定植的幾率[3]，被攔截下來的腫瘤細胞與血管內皮細胞相互作用形成腫瘤細胞的外滲。從物理生物學的角度研究，CTC clusters傾向于通過與E-鈣黏素相互作用發生邊緣化、旋轉和內皮的黏附[4]。CTC團簇的移動速度遠低于單個CTC，即使在直徑不足以攔截團簇的血管中，也易于邊緣化和附著在血管壁上。此外，這種簇狀結構還為其中的腫瘤細胞提供了特殊的微環境，并且該微環境根據簇的大小和組成而變化，細胞簇越大、連接越緊密，給腫瘤細胞提供的微環境更加低氧[5]，利于腫瘤細胞的生存。

近年來，研究人員發現CTC clusters還存在可變形性，Au等[6]使用微流體裝置和斑馬魚模型，發現包含≤20個細胞的CTC團簇能夠通過重組成單鏈狀幾何結構而通過毛細血管，且這些CTC團簇的形狀是高度可塑性的，在穿過毛細血管后，細胞能夠輕松地再次重組為球形簇，這一發現進一步加深了我們對基于CTC clusters的轉移的理解。

1.2 CTC clusters形成的分子機制血行轉移中CTC clusters的顯著特征是其表層具有血小板包被，但關于調控血小板黏附聚集形成細胞簇的分子機制卻少有報道，下面就幾種參與CTC clusters形成的關鍵蛋白進行闡述。

1.2.1Podoplanin誘導血小板黏附聚集促進CTC clusters形成 Podoplanin(PDPN)名為血小板聚集誘導因子Aggrus，也稱平足蛋白，是一種在多種腫瘤細胞表面表達的I型跨膜粘蛋白樣糖蛋白，它可以通過與血小板相互作用并激活血小板受體C型凝集素樣受體-2(C-type lectin-like receptor 2，CLEC-2)，促進腫瘤細胞與血小板相互聚集形成CTC clusters，從而促進腫瘤細胞血行轉移，有研究證明，抑制PDPN和CLEC-2受體的相互作用可以抑制CTC clusters的形成[7]。這些結果表明，PDPN可能通過促進血小板激活、血小板-腫瘤細胞相互作用繼而促進CTC clusters的形成，促進腫瘤細胞血行轉移。

1.2.2Fibronectin促進血小板與腫瘤細胞黏附和CTC Clusters形成 纖連蛋白(fibronectin，FN)是一種二聚體糖蛋白，廣泛參與細胞遷移、黏附以及止血等生理病理過程。血漿的FN在血液中循環，并且在組織損傷時，摻入纖維蛋白凝塊中以對血小板功能發揮作用并介導止血過程。FN在多種腫瘤中異常表達，對腫瘤細胞的轉移和血管生成等有促進作用[8]。FN是多種整合素受體的配體，在介導細胞黏附時，FN上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列可識別細胞表面整合素異二聚體并與之結合，進而影響細胞黏附、遷移等；在介導凝血過程中，FN與血小板整合素受體形成強力結合，促進血小板的黏附聚集及其促凝血活性[9]。FN還可通過與腫瘤細胞表面整合素αvβ3、αvβ6等相結合組裝于腫瘤細胞表面，與血小板表面整合素αIIbβ3結合促進血小板向腫瘤細胞黏附聚集，促進CTC clusters的形成[10]。

1.2.3Plakoglobin介導血小板黏附聚集促進CTC clusters形成 Plakoglobin(PG)也叫盤狀珠蛋白，與β-catenin同源，是黏著連接和細胞橋粒組成成分，介導細胞間的黏附作用。研究表明，敲除CTC clusters 中的PG或下調其表達可顯著減少CTC clusters 的形成和轉移，且以PG為腫瘤轉移靶標的抗腫瘤轉移治療策略在實際抗腫瘤轉移的藥物篩選中已經有所應用[11]。另一方面，PG參與并調節血小板內皮細胞黏附分子(CD31)的形成。敲低PG的表達，能夠顯著抑制CD31的活性，并使得E-cadherin的膜分布不穩定、integrin-β3活性下降，最終導致細胞黏附性降低、血小板聚集減少。PG還可以維持FN mRNA的穩定性，增加腫瘤細胞內源性FN的表達，而PG的缺失可顯著降低FN的表達、CTC Clusters的形成和遠端轉移[12]。

2 CTCs聚簇增強血行轉移能力的分子機制

腫瘤轉移實際上是個低效過程，相比大量進入血液循環的腫瘤細胞，能夠在遠端成功定植的少之又少。究其原因是CTCs失去原位腫瘤基質的依托，在血行轉移中面臨巨大的生存壓力，主要包括氧化應激、血流剪切力和免疫追殺等[13]，探究循環腫瘤細胞簇血行轉移能力增強的原因，對于臨床針對腫瘤轉移治療具有指導性作用。

2.1 細胞間黏附蛋白細胞間的黏附蛋白是CTCs在血液循環中以單個還是成簇類型存在的決定因素。相關報道顯示，黏附蛋白的高表達使得腫瘤細胞聚集成簇，增加其轉移潛力，大大縮短患者的生存期。例如，Plakoglobin在細胞間黏附結構中起到將E-鈣黏素和α-連環蛋白連接的作用，維持了循環腫瘤細胞簇狀結構穩定和細胞極性。除此之外，Plakoglobin還參與多種致癌信號通路，Kolligs等通過在大鼠RK3E上皮細胞中過表達Plakoglobin，促進了腫瘤轉移，潛在的分子機制是該蛋白的過表達導致c-Myc的上調和TCF/Lef信號的激活；Chen等[14]研究表明，敲除橋粒芯蛋白3(DSG3)會破環其與Plakoglobin的結合，并導致c-myc、cyclin D1和MMP-7下游靶基因的表達下調，從而抑制細胞遷移和侵襲。Fibronectin的合成受血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)以及轉化生長因子β1蛋白(TGF-β1)的調節，PDGF能夠誘導TGF-β1的分泌，從而促進FN的合成與沉積，在CTC Clusters中，血小板的黏附聚集促使其分泌PDGF和TGFβ-1，使得FN合成增多，進一步加強了CTC Clusters的穩定性，增加了其在血行轉移中的生存能力[12]。Takagi等[15]培育出了Podoplanin的人單克隆抗體——MS-1，并且發現它能夠抑制PDPN-CLEC-2結合、PDPN誘導的血小板聚集以及PDPN介導的腫瘤轉移。

總的來說，參與CTCclusters形成的蛋白涉及多條通路，在腫瘤的發生發展中起著重要作用，因此可能作為潛在的預后生物標志，成為治療腫瘤轉移的靶標。

2.2 腫瘤細胞的EMT過程上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種對胚胎形成、傷口愈合和腫瘤惡性進展至關重要的細胞程序，EMT導致細胞之間以及細胞與基質之間的相互作用被重塑，使得腫瘤細胞由遷移能力弱的上皮狀態向侵襲能力強的間質狀態轉化。同時，EMT增加了腫瘤細胞的轉移潛能，是腫瘤細胞產生耐藥性的重要原因[16]。

EMT相關的轉錄因子可以將非轉移性癌細胞轉變成能夠侵襲和轉移的細胞，有研究表明，胰腺癌小鼠模型中ZEB1和SNAIL的表達是癌細胞侵襲和轉移所必須的[17]，SLUG的表達可以使得原本非轉移細胞獲得轉移能力[18]，證實了EMT過程對于腫瘤轉移的重要性。而在成簇脫落的循環腫瘤細胞中經歷的是部分EMT，經過轉化后，外部以間質狀態存在，而內部仍保持上皮連接狀態，外周的間質細胞為內部上皮細胞的轉移鋪平了道路[19]。多項研究表明，上皮連接成分的持續表達對于CTC clusters本身的穩定性是必需的，而間質細胞則進一步增強了轉移潛能[20]。此外，來自同一腫瘤患者的CTC clusters中上皮/間質表達并不是恒定的，而是隨著耐藥性的產生，間質細胞的比例也隨之上升，當引入新的有效治療方案，間質細胞比例又急劇下降[21]。上述研究表明，CTC clusters中EMT特征不僅反映了其固有的侵襲性，還能反映治療方案的耐藥情況，但關于EMT在循環腫瘤細胞簇的轉移過程的具體狀態尚未得到完全闡明，探究影響上皮/間充質狀態的信號通路是開發靶向治療處于不同狀態腫瘤細胞的關鍵步驟。

2.3 DNA甲基化DNA甲基化異常，包括全基因組低甲基化和高甲基化，與多種人類癌癥相關，兩種表觀遺傳修飾均具有改變鄰近基因表達并促進癌癥發展的能力[22]。Gkountela等[1]通過分析來自乳腺癌患者和NSG小鼠異種移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX)中CTCs的DNA甲基化圖譜，發現了諸多甲基化差異區域(differentially methylated regions，DMRs)，單個CTC中低甲基化轉錄因子結合位點(Transcription factor binding sites，TFBS)包括JUN，MIXL1、SHOX2、MEF2C等，這些基因常在各種腫瘤中富集；而CTC聚簇導致主導干性和調節增殖相關基因的TFBS特異性低甲基化，例如OCT4、MANOG、SOX2和SIN3A，并伴隨有多梳抑制復合物2(polycomb-repressive complex 2，PRC2)目標基因啟動子和基因體(包括SUZ12和EED的靶標)超甲基化及H3K27me3抑制，這些改變共同增加了CTC clusters的血行轉移能力。循環中CTCs表型的差異決定了DNA甲基化狀態，因此監測異常的DNA甲基化可能是一種富有前景的提前發現腫瘤惡化的手段，可用于腫瘤的早期檢測、去甲基化治療和預后評估。

2.4 異質性來自同一個體血液循環中的CTC clusters并非簡單的由腫瘤細胞聚集而成，而是由腫瘤細胞、血小板、成纖維細胞和相關黏附蛋白等共同組成的，這些非腫瘤細胞成分有利于CTCs的生存和轉移。血小板通過旁分泌信號傳導和直接接觸來物理屏蔽其他復雜的影響，從而保護腫瘤細胞免受血液剪切損傷和免疫攻擊[23]。血小板還可以通過分泌TGF-β并與腫瘤細胞直接相互作用，通過TGF-β/Smad和NF-κB途徑誘導腫瘤細胞進行EMT。成纖維細胞的存在增加了CTC clusters內腫瘤細胞的活力，并促進了轉移的形成，而當癌癥相關的成纖維細胞部分耗盡時，可以觀察到轉移的數量明顯減少[24]。總而言之，CTC clusters復雜的組成具有明顯的異質性，未來的研究應著重于CTC clusters組成的動態變化，關注個各成分之間的相互作用及對轉移的影響。

3 CTC clusters在腫瘤轉移中的作用

腫瘤轉移是個復雜的、多步驟的過程，現代研究將腫瘤轉移過程大致分為以下環節，即：腫瘤細胞脫離原發部位、腫瘤血管生長、腫瘤細胞滲透進入血管、腫瘤細胞在血液循環中運行、腫瘤細胞溢出血管、腫瘤細胞在目的器官植入并生長。在整個腫瘤轉移過程中，CTC clusters在其中扮演了一個轉移前體“種子”的角色，通過血行轉移到達合適的“土壤”器官進行定植，最終形成轉移病灶。CTC clusters的分子特征體現了其生存優勢和轉移潛力，同時為腫瘤治療過程中產生耐藥性的機制提供了新的線索。當前對CTC clusters的研究集中在影響CTC clusters內腫瘤細胞聚集的分子，這些分子可能成為治療的良好靶標。在乳腺癌的研究中已經發現，盤狀珠蛋白和角蛋白-14與橋粒和半橋粒密切相關，對CTC clusters的形成至關重要[11,25]，抑制這些蛋白的表達可減少CTC clusters的形成和腫瘤的轉移。此外，一些促炎細胞因子，例如白介素-6和腫瘤壞死因子-α也可以促進腫瘤細胞成簇生長，并在循環系統中誘導黏附募集[26]。

現有的研究部分闡明了CTC clusters具有更高轉移潛能的原因，主要涉及黏附聚集、甲基化、EMT、異質性等。此外，還有報道表明，CTCclusters通過循環的galectin-3和癌癥相關的粘蛋白1(MUC1)之間的相互作用減少凋亡，同時促進了CTC clusters在循環系統中的形成和存活[27]。通過與腫瘤細胞表面的MUC1相互作用，循環中升高的galectin-3也促進了腫瘤與內皮細胞間的黏附。這些發現進一步加深了我們對CTC clusters轉移機制的認識，并提供了一種預防轉移的新穎治療方法。

4 CTC clusters的臨床治療價值

CTC clusters在腫瘤患者的早期檢查、治療效果評估和腫瘤復發檢測等方面具有巨大的潛力，且已經參與了許多臨床前研究和臨床試驗。研究人員對CTC clusters臨床意義的探究，發現患者循環中存在的CTCs與不良生存結局密切相關。

針對細胞簇的治療手段也逐年興起。Aceto等[2]通過篩選2 486種FDA批準的化合物，發現Na+/K+-ATP酶抑制劑通過增加細胞內鈣離子濃度，可以抑制腫瘤細胞間緊密連接和橋粒的形成，達到解離CTCclusters的效果，并在小鼠模型上證實了其對腫瘤轉移能力的抑制作用。

人類和實驗動物中的大多數實體瘤都包含大量的纖維蛋白，提示纖維蛋白和纖維蛋白原在腫瘤發生和轉移中發揮重要作用。研究發現，低分子量的肝素可直接導致血纖維蛋白溶解，肝素治療的患者具有明顯的生存收益，但研究尚未證實肝素和其他抗血栓形成藥物的抗腫瘤轉移作用是否對臨床有益。目前，溶栓劑(如尿激酶)破壞細胞聚集的能力已得到充分證明，該特性有時可用于癌癥患者血管內凝血，Choi JW等將尿激酶靜脈注射到肺癌模型小鼠，成功提高了小鼠的存活率，顯示了針對CTC clusters的治療潛力，解離循環中的CTC clusters可以很大程度減少癌癥的轉移[28]。因此，除了靶向黏附蛋白外，直接作用血纖蛋白原可能是控制CTC clusters的另一種有前景的方法。

治療期間CTC clusters的基因表達和變化也引起了研究人員的注意，在前列腺癌患者中，抗氧化劑基因的表達水平具有良好的預后和預測價值，可用于評估治療和監測腫瘤復發。血行轉移中，Zhang等[29]發現編碼COX-2的PTGS2基因上調程度較高,COX-2是誘導型酶，在乳腺癌，結直腸癌，肺癌和胰腺癌和黑素瘤中經常過表達，并且與不良預后相關，可將花生四烯酸轉化為前列腺素，提高癌細胞存活率，增加生長、遷移、侵襲能力和干細胞樣特性，并且與血管生成和免疫抑制相關，揭示了COX-2抑制劑在抗轉移中的潛在應用。

CTC clusters的臨床價值毋庸置疑，通過解離CTC clusters或許可以減少腫瘤的轉移，但解離后形成的單個CTC對轉移的影響仍然也需要注意，因此，關于CTC clusters合理的臨床應用策略還需要進一步研究。

5 總結與展望

在腫瘤細胞的血行轉移過程中，與單個CTC相比，CTC clusters賦予了腫瘤細胞更強的生存能力。通常脫離基質的腫瘤細胞首先面臨失巢凋亡的威脅，而乳腺癌PDX模型中CTC clusters的RNAseq分析結果顯示凋亡相關的信號通路整體下調，這與檢測到抗凋亡蛋白Bcl-2過表達的結果相一致，共同增加了CTC clusters的抗凋亡能力。進入循環中CTC clusters主要面臨血流剪切力以及免疫系統的殺傷，目前普遍認為CTC clusters中發生的部分EMT使其產生的可變形性是抵抗血流剪切力的主要原因，而免疫逃逸涉及多種機制，例如免疫檢查點在CTC clusters中過表達、II型干擾素和TNF信號傳導途徑下調、T細胞激活基因的下調等[13]。總的來說，CTCclusters對腫瘤血行轉移更為重要，能夠完整的顯示CTCs攜帶的遺傳信息，更適合作為液體活檢的生物標志物來評價治療效果、檢測腫瘤復發以及用于預后評估。

但在CTC clusters的研究中仍有幾個問題亟待解決，首先是CTC clusters的分離檢測難題，目前的分離系統主要是針對單個CTC的分離篩選，而CTC clusters因其在循環中的稀有性導致了捕獲難度大幅增加，形態上個體差異大，難以匹配合適的孔徑，且容易造成濾孔堵塞，使得捕獲后不易完整釋放，進而影響下游分析，因此首要目標是確定一套合適的分選技術和評價標準[30]。其次，CTC clusters的形成機制尚未完全解釋清楚，目前報道的PDPN、FN和PG等黏附蛋白在介導血小板結合腫瘤細胞形成CTC clusters中發揮了重要作用，通過探究CTC clusters的形成機制，可以更好的指導臨床合理用藥進行針對治療。最后，CTC clusters內部的異質性始終是個復雜問題，關注CTC clusters組成的動態變化，探究各個成分之間的相互作用及對轉移能力的影響也是未來研究的主要方向。