內質網氧化還原蛋白1及其與腫瘤關系的研究進展

吳 敏 綜述，黃尤光 審校

(昆明醫科大學第三附屬醫院/云南省腫瘤醫院腫瘤研究所 650118)

惡性腫瘤已經成為威脅人類生命健康的主要公共衛生問題之一，據美國最新癌癥數據顯示，2020 年美國將有 1 806 590 例新發癌癥患者和 606 520 例癌癥死亡患者[1]。隨著惡性腫瘤發病率和病死率的持續攀升，且缺乏有效的干預策略以提高患者的生存率，因此尋找新的治療靶點已經成為近年來的研究熱點。近年來研究表明，內質網氧化還原蛋白 1(endoplasmic reticulum oxidoreductin 1，ERO1)在多種類型的腫瘤組織和細胞系中高表達，且與腫瘤患者的不良預后有關，還與腫瘤的惡性生物學行為密切相關[2-5]，因而深入研究 ERO1與腫瘤的關系，或將成為新的腫瘤治療干預靶點。

1 ERO1家族概述

ERO1是一種與內質網(endoplasmic reticulum，ER)膜腔緊密結合的糖基化黃素酶，其主要作用是參與二硫鍵的形成，從而維持蛋白質的正確折疊，其基因定位于 14 號染色體上，基因組序列含有16個外顯子和 15 個內含子[6-7]。在哺乳動物中有兩個與酵母 ERO1p 同源的蛋白質，稱為ERO1α和 ERO1β。ERO1α和 ERO1β 顯示出不同的組織分布，ERO1α 在人體的多種組織中均有表達，而 ERO1β 主要在分泌組織中高表達，如胰腺和胃[8]。此外，二者在轉錄調控中也顯示出一定差異：ERO1α 由低氧條件誘導，而 ERO1β 表達由未折疊蛋白反應 (unfolded protein response,UPR)優先誘導[9]，表明 ERO1的激活有一定程度的選擇性。

2 ERO1的生物學功能

蛋白質的氧化折疊主要發生在真核細胞ER中，是新生肽鏈折疊成天然蛋白形成正確二硫化物的過程。二硫鍵的形成對于維系分泌蛋白和膜結合蛋白的結構和功能至關重要，且二硫鍵的錯配會顯著增加未折疊蛋白反應的發生，而真核生物內質網中二硫鍵形成的兩個主要參與者是二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase,PDI)和 ERO1[10]。PDI 可直接催化還原底物中二硫化物的形成，并且可以通過異構化反應將非天然二硫鍵轉化為天然二硫鍵，從而糾正蛋白質的錯誤折疊[11]。ERO1可氧化被還原的PDI結構域[12]，使蛋白質氧化折疊開始新的循環，并通過其非共價結合的黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)，將電子轉移到分子氧，產生H2O2[11,13]。此外，有研究表明 ERO1除了參與蛋白質二硫鍵的形成，還參與代謝的調節，比如促進睪丸激素的分泌、調節類固醇的生成和胰島素分泌[9,14-15]。

3 ERO1在腫瘤中的表達及與預后的關系

新近研究表明，相較于正常細胞和組織中的 ERO1水平，ERO1在肝癌、胰腺癌、膽管癌、宮頸癌、乳腺癌等多種類型的癌細胞和癌組織中高表達，且與腫瘤患者的不良預后密切相關[2-5,16]。ZHANG等[17]對 205 例胰腺導管腺癌患者的癌組織標本和癌旁組織標本進行分析后發現，ERO1高表達的胰腺導管腺癌患者總生存率顯著低于 ERO1低表達患者，且 ERO1的表達與腫瘤的大小和組織學分化密切相關。YAN等[4]收集了 186 例膽管癌組織標本和 36 例癌旁組織標本，發現 ERO1在膽管癌組織中的陽性表達率為 84.9%，而在癌旁組織中表達率為 0，進一步對 ERO1表達與臨床病理和患者預后進行相關分析后表明，ERO1的高表達與臨床分期和病理分期密切相關，且 ERO1的表達是膽管癌患者生存的獨立危險因素。同樣地，YANG等[2]收集了 114 例原發性肝癌患者的術后癌組織和癌旁組織，發現腫瘤組織中的ERO1α mRNA 和蛋白水平明顯高于癌旁組織，且ERO1α高表達的肝癌患者 5 年總生存期較ERO1α低表達的肝癌患者低，無復發、生存期縮短，此外經 RT-qPCR 檢測后發現ERO1α高表達與腫瘤轉移顯著相關。綜上，ERO1在腫瘤組織中高表達，且與腫瘤患者預后密切相關，提示 ERO1也許可作為腫瘤患者預后新的生物標志物。

4 ERO1表達對腫瘤細胞惡性生物學行為的影響

腫瘤細胞的過度增殖、高度遷移、侵襲和轉移能力是惡性腫瘤的主要特征，也是惡性腫瘤患者不良預后的主要原因之一。已有研究表明實體腫瘤中大多都存在低氧的微環境，其有助于腫瘤細胞的侵襲和轉移，同時容易產生耐藥性，進而限制了抗腫瘤療效[18-19]，而ERO1α在缺氧條件下其表達可顯著升高[20]。

4.1 ERO1表達與腫瘤細胞增殖和凋亡

ZHANG等[5]研究表明，敲低宮頸癌 HeLa 細胞中ERO1α的表達會明顯抑制HeLa 細胞的增殖，使 HeLa 細胞周期被阻滯于G1期。GUPTA等[3]使用 CRISPR/Cas 基因組編輯技術沉默胰腺癌細胞中ERO1α的表達后，發現胰腺癌細胞的增殖能力顯著降低，且明顯抑制了胰腺癌細胞的克隆形成能力，進一步建立裸鼠皮下成瘤模型后，發現沉默ERO1α表達組的裸鼠其皮下成瘤能力較未沉默組顯著降低。此外，筆者團隊經過前期研究同樣發現，敲低結腸癌細胞中的ERO1α的表達可以抑制結腸癌細胞的增殖，同時可以顯著促進結腸癌細胞的凋亡[21]。上述體外和體內實驗結果均表明，ERO1的表達不僅可以促進腫瘤細胞增殖，還可以抑制腫瘤細胞的凋亡，從而促進腫瘤細胞存活。

4.2 ERO1表達與腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移

YANG 等[2]通過細胞劃痕、Transwell 遷移和侵襲實驗表明，敲低肝癌細胞中ERO1α的表達后，可以顯著抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力。HAN等[22]研究表明敲低胰腺癌細胞中 ERO1的表達時，胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力明顯降低，進一步檢測了裸鼠皮下移植瘤組織中侵襲、轉移相關蛋白 MMP-2 和 MMP-9 表達后發現，敲低 ERO1抑制了 MMP-2 和 MMP-9 的表達。此外，體內動物實驗也同樣表明，與注射了野生型乳腺癌細胞的小鼠相比，注射了敲低ERO1α表達的乳腺癌細胞的小鼠，其體內腫瘤生長延遲，且體內腫瘤的肺轉移數也顯著降低[23]。綜上所述，ERO1的高表達顯著促進腫瘤細胞發生惡性遷移、侵襲和轉移，深入研究 ERO1與腫瘤發生發展間的關系及具體機制，靶向 ERO1可有望成為惡性腫瘤治療的潛在新策略。

5 ERO1在腫瘤發生發展中的作用機制

5.1 ERO1調控腫瘤血管生成

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種高度特異性促血管內皮細胞生長的因子，其在促進腫瘤新生血管的生成中發揮重要作用，而新生血管的生成是惡性腫瘤具有侵襲性的重要標志之一。TANAKA等[16]分別將低表達ERO1α的乳腺癌細胞和過表達ERO1α的乳腺癌細胞注入小鼠乳腺后，發現過表達ERO1α顯著增加了腫瘤組織中血管的數量，而敲低ERO1α的表達則明顯抑制了腫瘤血管的生成。KUTOMI等[23]敲低乳腺癌細胞中ERO1α的表達后，發現乳腺癌細胞分泌的 VEGF 明顯減少。此外，YANG等[2]檢測了肝癌組織中的 VEGF 表達，發現 VEGF 水平與肝癌發生轉移密切相關，且轉移性肝癌標本中 VEGF 水平上調與ERO1α過表達呈正相關，同時進一步分析發現 ERO1α低表達的肝癌細胞其 VEGF 的 mRNA 和蛋白表達水平明顯低于過表達ERO1α的肝癌細胞，且發現了ERO1α可通過S1PR1/STAT3/VEGF-A 信號通路促進血管生成。ERO1主要參與二硫鍵的形成，而 VEGF 需要形成二硫鍵以發揮其生物活性，因此，ERO1與腫瘤血管的生成密切相關，且 ERO1不僅通過介導 VEGF 的氧化蛋白折疊來發揮作用，還通過增加 VEGF 的 mRNA 表達來增加 VEGF 的分泌。

5.2 ERO1調控腫瘤上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

EMT 在腫瘤惡性進展中發揮重要作用，EMT 不僅會促進腫瘤發生侵襲和轉移，同時還會增加腫瘤對臨床干預的耐受[24]。有研究表明在肝癌細胞中敲低ERO1α 的表達后，EMT 相關蛋白 E-鈣黏蛋白表達水平升高，而波形蛋白(Vimentin)和鋅指轉錄因子Snail2表達水平降低，且在過表達ERO1α的肝癌細胞中得到相反的結果，同樣地在ERO1α低表達和過表達的肝癌細胞免疫熒光顯示出相同的結果[2]。TAKEI等[7]敲低結腸癌細胞中ERO1α的表達后，發現 E-鈣黏蛋白表達增加，而鋅指轉錄因子 Snail 的表達及整合素連接激酶1(ILK1)的表達減少。ZHANG等[5]的實驗同樣表明在宮頸癌細胞中敲低ERO1α的表達后，EMT促進蛋白的表達水平明顯降低，且用活性氧清除劑 N-乙酰半胱氨酸處理宮頸癌細胞后，發現其抑制了ERO1α過表達觸發的 EMT 信號傳導現象，表明了ERO1α可能通過其副產物以增強腫瘤細胞發生 EMT。以上實驗結果提示，ERO1通過參與腫瘤細胞 EMT 過程的調控，從而促進腫瘤細胞侵襲和轉移。

5.3 ERO1調控腫瘤免疫

在生理條件下，機體的免疫系統可以及時識別并清除腫瘤細胞，而惡性腫瘤卻能夠采用不同生存策略，在抗腫瘤免疫應答的各階段得以幸存，但其具體的調控機制目前尚未完全明確。有研究表明腫瘤細胞中高表達的ERO1α促進了粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，趨化因子CXCL1和CXCL2的氧化折疊，用于誘導和募集多核型髓源抑制性細胞，從而抑制抗腫瘤T細胞介導的免疫應答[25]。TANAKA等[26]研究表明ERO1α不僅可以通過促進程序性死亡配體-1(programmed death-ligand 1,PD-L1)的氧化蛋白折疊來上調 PD-L1 的表達，還可通過ERO1α產生ROS從而上調缺氧誘導因子-1α 的表達水平，導致 PD-L1 mRNA 的表達增加，而 PD-L1在腫瘤發生免疫逃逸中起關鍵作用。綜上，ERO1在調控腫瘤免疫的過程中發揮著重要作用，ERO1的過表達不僅促進了腫瘤細胞免疫逃逸，且可通過抑制抗腫瘤 T 細胞的免疫應答來促進體內腫瘤生長，這為建立有效的腫瘤免疫治療提供了新思路。

5.4 其他作用機制

整合素β1 是整合素的亞家族之一，主要介導細胞與細胞外基質間的信號傳遞，且參與惡性腫瘤的侵襲和轉移[27]。TAKEI等[7]發現在缺氧條件下，敲低ERO1α 在結直腸癌細胞中的表達會影響整合素β1的N-糖基化和膜轉運，導致腫瘤細胞表面的整合素 β1 表達減少，從而使ERO1α低表達的腫瘤細胞表現出更高的接觸抑制特性，提示在缺氧條件下ERO1α通過調控整合素信號傳導，使腫瘤細胞失去接觸抑制的特性。 Akt/mTOR 信號通路在腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡等過程中發揮重要作用。YAN等[4]研究表明在沉默膽管癌細胞中ERO1α的表達后，AKT/mTOR 信號通路的效應蛋白p-Akt、p-4EBP1和p-S6 的表達明顯降低，在過表達ERO1α 的細胞中得到相反的結果，且在進一步使用 Akt 通路抑制劑以后，發現ERO1α的蛋白水平無明顯改變，提示了ERO1α是 Akt/mTOR 信號通路的上游調控分子，ERO1α 可通過調控 Akt/mTOR 信號通路促進惡性腫瘤的進展。JNK 信號通路是絲裂原活化蛋白激酶三大主要信號通路之一，主要參與調控細胞周期、增殖和凋亡等生理及病理過程[28]。SEOL等[29]敲低胃癌細胞中ERO1的表達后，JNK 的磷酸化明顯降低，表明敲低ERO1表達對JNK信號通路有抑制作用，提示ERO1可能通過調控JNK信號通路的活化，以調節腫瘤的發生發展。此外，有研究表明在胰腺癌細胞中過表達ERO1激活了Wnt/catenin信號通路，并上調Wnt/catenin信號通路的相關靶蛋白，從而調節胰腺癌的進展[22]。綜上，ERO1可能通過調控多條信號通路，從而調節腫瘤的惡性進展過程，但具體機制有待進一步研究。

6 ERO1表達與腫瘤耐藥關系

目前，化療是治療惡性腫瘤的主要治療方法之一，但隨著化療耐藥不斷增加，腫瘤耐藥性已經成為當今全世界都亟待解決的一個問題。研究表明通過沉默胃癌細胞中 ERO1的表達，可明顯增加胃癌細胞對5-氟尿嘧啶和紫杉醇的敏感性，顯著增強抗腫瘤療效[29]。此外，HAYES等[30]對 76 例接受地塞米松治療和 188例接受硼替佐米治療的多發性骨髓瘤患者的分析表明，在同樣接受地塞米松和硼替佐米治療的情況下，ERO1高表達的多發性骨髓瘤患者其總生存期明顯低于ERO1低表達的患者。這些結果提示，ERO1可能是腫瘤發生耐藥性的原因之一，且與藥物本身的作用機制無關，ERO1也許可作為抗腫瘤治療過程中監測腫瘤患者發生耐藥性的一個生物標志物。

7 小 結

ERO1是維持機體穩態的重要物質，其不僅參與二硫鍵形成，還能夠調控機體的正常代謝。在各種損害因素作用下可促進機體ERO1過表達，并通過調控腫瘤血管生成、EMT和腫瘤免疫等多種信號通路促進惡性腫瘤的發生發展。ERO1的表達水平不僅與腫瘤惡性進程相關，且和腫瘤患者不良預后密切相關，提示 ERO1或能作為惡性腫瘤的診斷生物標志物和治療靶點。目前關于 ERO1在腫瘤中的具體作用機制尚未明確，未來需要更多的基礎和臨床研究來進一步闡明 ERO1在調控腫瘤發生、侵襲、轉移中具體機制，為臨床防治腫瘤提供新見解和新手段。