胸腺上皮細胞發育分化的信號通路研究進展①

陳昌蓉 宋銀宏（三峽大學醫學院病原與免疫學系，感染與炎癥損傷研究所，宜昌443002）

胸腺屬于上皮-間質組織，分為皮質和髓質區，內含基質細胞和胸腺細胞［1］。胸腺微環境為T淋巴細胞增殖、分化和選擇性發育提供了場所。胸腺上皮細胞（thymus epithelial cells，TECs）是胸腺微環境最主要成分。根據表型和定位，TECs可分為皮質胸腺上皮細胞（cortical thymic epithelial cells，cTECs）和髓質胸腺上皮細胞（medullary thymic epithelial cells，mTECs）［2］。隨著年齡增長，胸腺在青春期以后會出現退化，而TECs數量減少、功能紊亂是胸腺退化的重要因素之一，可導致胸腺細胞發育、增殖缺陷以及外周T細胞功能障礙［3］。T細胞衰老使老年人更容易受到感染和癌癥的影響，若能重建T細胞，將防止或逆轉與老化相關的T細胞衰竭［4］。T細胞發育過程中與TECs相互作用，并涉及許多信號通路［5］。在細胞水平上可以將與TECs發育相關的信號通路分為細胞內信號分子核因子-κB（nuclear fac?tor kappa B，NF-κB）及其信號通路、細胞外信號分子骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，Bmp）、Wnt蛋白、音猬因子（sonic hedgehog，Shh）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGF）等及其相應通路、其他類信號通路如視黃酸（retinoic ac?id，RA）、缺刻分子（notch）及相應通路。研究TECs發育分化過程中涉及的重要信號通路將有助于更加全面理解胸腺微環境，為對抗胸腺退化和提高機體免疫力提供研究基礎。

1 調控TECs發育分化的細胞內信號通路

1.1 轉錄因子 轉錄因子是高度保守的能識別DNA序列進而調控基因表達的蛋白質［6］。在胚胎發育第11～12天，源自骨髓的淋巴樣祖細胞定植到胸腺組織，隨后進行TECs的發育及分化［7］。第三咽囊TECs發育早期受到1組轉錄因子的調節，其中主要包含同源盒基因3（homeotic genes 3，Hoxa3）、配對盒基因1/9（paired box genes 1/9，Pax1/9）、眼缺失基因（eyes absent gene，Eya1）、Six1/4（six gene 1/4）和T-盒轉錄調控因子1（T-box transcription factor，Tbx1）［8-10］。在胚胎或出生后個體的胸腺中，叉頭框轉錄因子（forkhead box）家族成員中的Foxn1在TECs發育階段中最為重要［11］。各種信號轉導途徑調控Foxn1的表達及TECs的增殖、發育及分化。

1.2 NF-κB NF-κB家族包括NF-κB1（p105）、NFκB2（p100）、網狀內皮增生病毒致癌基因同源物A（reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，Re?lA）、RelB和c-Rel，這些轉錄因子形成同源和異源NF-κB/Rel二聚體，參與炎癥、應激反應、淋巴器官發育等不同的生物學過程［12］。當細胞處于靜息狀態時，κB抑制性蛋白（inhibitor of kappa-B，IκB）與NFκB/Rel二聚體結合組成異源多聚體，以無活性形式存在于細胞質中。在經典NF-κB信號通路中，多種刺激物可以激活IκB激酶（inhibitor of kappa B kinas?es，IKKs），使IκB磷酸化，并通過泛素-蛋白酶體途徑降解，引起NF-κB1/RelA和NF-κB1/c-Rel異源二聚體的核易位以啟動靶基因表達。而腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor，TNFR）和經典NF-κB信號通路能共同激活非經典NF-κB通路。TNFR家族成員包括淋巴毒素β受體（lymphotoxinβ receptor，LTβR）、CD40和核因子κB受體活化子（re?ceptor activator of nuclear factor-κB，RANK）。當這些受體分子接受相應信號分子時，可以將信號轉給接頭蛋白TNF受體相關因子（TNF receptor associated factor，TRAF），TRAF隨后激活NF-κB誘導激酶（nu?clear factor kappa Binducing kinase，NIK），活化后的NIK可以激活IKKα二聚體［13］。IKKα二聚體將NFκB2（p100）的羧基端殘基磷酸化后導致NF-κB2（p100）泛素化，進而通過蛋白酶體加工成NF-κB2/p52并轉運入胞核，啟動細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、原癌基因（c-myc）等目的基因表達。

mTECs發育依賴于經典NF-κB途徑，RelA、c-Rel激活后能直接調控RelB的表達，并最終調控mTECs分化；若TECs中的RelB完全失活，則導致機體的自身免疫疾病［9］。在胚胎發育過程中，mTECs祖細胞接受LTβR信號傳導，激活非經典NF-κB途徑 后RANK表 達 上 調［11，14］。RANK與 其 配 體（RANK ligand，RANKL）結合后，能刺激TECs增殖［15］。RIEMANN等人［16］揭示了經典和非經典NFκB通路之間建立mTECs自身免疫耐受的串擾機制，主要是通過誘導RelB的表達，共同作用并調控TECs的發育成熟，確保誘導T細胞的自身耐受。

1.3 組蛋白去乙酰化酶3 組蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）屬于Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶，具有調控染色質重塑和基因表達的作用［17］。mTECs分化需要HDAC3的參與。GOLD?FARB等人［18］通過RNA測序發現，TECs及各個亞群都高表達HDAC3，當條件性敲除TECs中的HDAC3后，mTECs幾乎完全消失。根據qPCR結果，依賴于HDAC3特異轉錄因子包括Pou2f3（pou class 2 ho?meobox 3）、神經母細胞特異性轉移因子（achaetescute complex homologue 1，AscL1）、FEZ家族鋅指蛋白2（FEZ family zinc finger 2，Fezf2）、Ehf（extended hartree-fock）和SpiB。此研究證實了HDAC3是調控TECs分化的強有力的轉錄因子。

1.4 轉錄激活子3 新生鼠的胸腺髓質區形成胰島樣結構，隨著時間增長，在出生幾周后融合成1個連續的結構。除上述NF-κB信號參與mTECs發育以外，SATOH等［19］使用條件基因敲除鼠模型去除TECs中的信號轉導和轉錄激活子3（signal transduc?er and activator of transcription 3，Stat3），證實Stat3介導的信號決定了髓質的結構從而決定了出生后髓質區的大小。

由以上可知，經典以及非經典NF-κB信號均能調控mTECs的發育。除了NF-κB信號以外，還有HDAC3和Stat3信號也能調控mTECs的發育。HDAC3是獨立于NF-κB信號來參與mTECs的整個發育過程，此外Stat3信號是新生鼠mTECs發育所必需的。

2 調控TECs發育分化的細胞外信號分子及其通路

2.1 Bmp信號 Bmp是轉化生長因子-β（transform?ing growth factor-β，TGF-β）超家族成員，在多種器官的形成和維持中發揮重要作用。Bmp信號通路主要由配體家族、受體以及下游信號分子Smads蛋白組成［20］。Bmp信號是由2個Ⅰ型Bmp受體和2個Ⅱ型Bmp受體組成的多聚體復合物傳遞，其中Ⅰ型和Ⅱ型Bmp受體是具有胞內絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域的單次跨膜蛋白。配體家族按照發現的時間順序分為Bmp、生長分化因子（growth differentiation factor，GDF）、TGF、激活素（Activins）、Nodal和抗繆勒氏管激素（anti-mullerian hormone，AMH），這些分子總稱為TGF-β超家族［21］。Smads是強有力的調控因子，其本身轉錄能力較弱，但卻能通過染色質重塑和組織特異性機制轉導信號。配體結合受體后，Ⅱ型Bmp受體磷酸化Ⅰ型受體，激活后的Ⅰ型受體招募并磷酸化受體調控Smads蛋白（receptor-regulat?ed smads，R-Smads）、Smad2和Smad3，進 而通過Smad蛋白將細胞表面的信號轉運至細胞核，從而調控如Foxn1等靶基因表達［20］。

Bmp信號在TECs發育最早階段起重要作用［22］。體外分析Bmp4對胎兒胸腺器官培養物（fetal thymic organ culture，FTOC）中胸腺細胞發育的影響，結果表明Bmp可阻滯胸腺細胞早期發育［23］。SWANN等人［24］使用Foxn1：Noggin轉基因小鼠模型，通過去除間質區的Bmp信號后導致Foxn1在咽上皮細胞中的表達缺失，從而減少了胸腺中的功能性TECs的數量。該實驗說明了胸腺生成早期階段的復雜性，并表明了Bmp信號與Foxn1協同作用決定了有功能活性的TECs數量。盡管了解到在胸腺發育過程中，Bmp4下游關鍵靶基因是Foxn1，但對于如何啟動Foxn1以及后續的TECs發育過程還尚無報道。

由以上研究可知，Bmp信號通路不僅在胸腺細胞發育早期階段起作用，并且在TECs發育最早階段也同樣發揮重要作用。Bmp信號通路通過Foxn1靶基因調控TECs發育，但對于信號通路上下游具體的分子機制仍有待深入研究。

2.2 Wnt信號 Wnt蛋白是一類分泌型的糖蛋白，在胸腺內由TECs分泌，Wnt信號在動物胚胎的器官發育、組織再生和其他生理過程中發揮重要作用［25］。Wnt信號通路主要成員有分泌蛋白Wnt家族、跨膜受體Frizzled家族、糖原合酶激酶3β（glyco?gen synthase kinase，GSK3β）、軸蛋白（Axin）、結腸腺瘤性息肉蛋白（adenomaous polyposis coli，APC）、β-連環蛋白（β-Catenin）、以及T細胞因子（T-cell fac?tor，TCF）［26］。研究最多的是經典Wnt信號通路，β-Catenin是此信號通路的關鍵蛋白。在沒有Wnt信號時，位于胞質中的β-Catenin被Axin-APC-GSK3β形成的巨大蛋白復合體捕獲并被降解。當Wnt與受體Frizzled和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6結合后，引起一系列下游級聯反應，β-Catenin從Axin-APC-GSK3β降解復合物中釋放并積累于細胞質中，然后進入細胞核與TCF結合，從而激活下游Foxn1、c-myc、Cycin D1等靶基因的轉錄［27］。

與Bmp信號不同，Wnt信號主要促進了TECs后期階段的發育［22］。HEINONEN等人［26］使用常規和突變小鼠模型，研究了Wnt4信號如何通過依賴于TECs機制調控胸腺的穩態，結果發現，Wnt4通過促進TECs及胸腺祖細胞的增殖來調控胸腺細胞的組成。LIANG、OSADA等［28-29］也報道，條件性基因敲除TECs中的β-Catenin或者過表達Wnt抑制劑都會導致胸腺萎縮。

由以上研究可知，Wnt信號通路在TECs發育過程中發揮重要作用。如果阻斷該信號通路中關鍵的靶基因，那么胸腺的發育將受損。

2.3 Shh信號 哺乳動物刺猬因子（hedgehog，Hh）家族成員包括Shh、印度刺猬因子（indian hedgehog，Ihh）和沙漠刺猬因子（desert hedgehog，Dhh），它們共享同1個信號通路，廣泛參與胚胎發育分化多個過程［30］。Shh信號主要由分泌型Shh配體、補綴同源物1（patched homolog，Ptch1）、平滑同源物（smoothened homolog，Smo）及下游的轉錄因子神經膠質瘤關聯癌基因同源物（glioma associated oncogene homolog，Gli）組成［31］。當Hh蛋白與其細胞表面受體Ptch1結合后，即可解除正常情況下Ptch1對Smo的抑制，隨后，Smo進入細胞，信號通路的末端是Gli1、Gli2和Gli3轉錄因子，進而發揮轉錄調控作用。Hh信號通路激活時，Gli2和Gli3能激活靶基因轉錄，當Hh信號通路失活時，Gli2和Gli3則阻止靶基因轉錄。

Shh信號在胸腺中表達后能調節T細胞的發育，但對TECs的發育分化作用不明確。SALDNA等人［31］用Gli-綠色熒光蛋白轉基因報告小鼠模型，探討了胎兒和成年期胸腺中的Shh信號通路對TECs發育分化的影響。結果表明，Hh信號通路在胎兒和成年胸腺的TEC中均有表達并且轉錄活躍；如果胎兒胸腺的TECs缺失Shh信號，則TECs數量減少、mTECs相對于cTECs數量也明顯減少，并且cTECs和mTECs中的主要組織相容性復合物（major histo?compatibility complex，MHC）的表達均增加；Shh-/-、ShhcoKO以及Gli3-/-小鼠突變體條件性敲除成年小鼠TECs中的Shh也會引起TEC分化發生改變以及T細胞發育的變化，導致TECs數量、表達自身免疫調節因子的mTECs的比例減少［31］。

由以上研究可知，Shh信號通路在TECs內轉導活躍、調控TECs尤其是mTECs的分化過程，以及調節cTECs和mTECs表面的MHCⅡ的表達。如果TECs缺失Shh，那么將引起TECs分化改變，進而使胸腺發育不良。

2.4 FGF信號 FGF在哺乳動物中包括22種多肽，能調節多種細胞遷移、增殖、分化、代謝以及神經發育過程。根據系統進化分析結果，FGF家族在小鼠和人類中存在7個亞家族，分別為FGF1、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF19亞家族［32］。除了FGF11亞類是作用于細胞內以外，FGF能結合并激活4種跨膜酪氨酸激酶受體（FGFR1～FGFR4），引起細胞內信號傳導級聯反應，而上皮細胞中主要表達FGFIIIb［33］。一旦FGF高親和力結合受體后，可激活不同信號通路，其中最為重要的信號通路為Ras-ERK 1/2信號通路［34］。此外，FGF可與其他信號分子相互作用，特別是Wnt信號，可共同參與組織再生過程。Shh和BMP同樣能和FGF相互作用控制肢體再生的過程［34］。

TECs發育分化后需要擴增細胞數量，這有利于形成完整的胸腺微環境。FGF又稱為角質細胞形成因 子（keratinocyte growth factor，KGF）。FGF7、FGF10由胸腺成纖維細胞分泌，它們的共同受體為FGFR2IIIb，其可促進TECs擴增而不是分化過程。ERICKSON等［35］發現在重組激活基因（recombina?tion activating gene，RAG）敲除的小鼠中體內注射重組KGF可以擴大發育不良的髓質小室，因此KGF和FGFR2IIIb信號傳導可以影響TECs發育和功能。另外，所有上述的BMP、Wnt、Hh和FGF細胞外信號還能在體外促進胚胎干細胞來源的內胚層向表達Foxn1的TECs祖細胞方向分化［36-37］。

由上述可知，FGF主要是能使發育分化后的TECs數量擴增，從而有利于形成穩定的胸腺微環境。但是目前對于FGF信號通路的分子機制還有待于進一步的研究。

3 其他信號通路

除了上述細胞外分子和細胞內分子及相關信號以外，非上皮組織中的其他外部信號也參與調控胚胎時期或出生后TECs發育過程。RA是調控TECs功能和胸腺生成的重要調節因子，去除TECs中RA信號后，cTEC和CD80loMHCⅡlomTECs中與上皮細胞增殖、發育與分化相關的基因表現出亞群特異性的改變；而且cTEC有明顯的增殖，這些改變導致胸腺細胞減少，幼年和成年小鼠的CD4、CD8單陽性細胞數量減少［38］。同樣，Notch信號對于各種上皮細胞類型的分化至關重要，TECs表達各種Notch受體及下游的發狀分裂相關增強子（hairy/en?hancer-of-split related with YRPW motif 1，Hey1）和Hey2靶基因，這表明激活了未成熟TECs中的Notch信號，抑制TECs分化，當依賴于Foxn1過度激活Notch1后會嚴重損害TECs發育，并使胸腺發育異常和萎縮［18，39］。研究表明通過Foxn1.Cre介導經典Notch信號通路激活Rbpj（recombining binding pro?tein suppressor of hairless）的缺失發現TECs數量變化不明顯，表明TECs發育后期不需要Notch信號的參與［5］。與Wnt、BMP、Shh信號不同的是，Notch信號是通過細胞與細胞間通訊發生的［40］。

由上可知，TECs發育分化需要細胞內、細胞外以及其他類信號分子的參與，它們相互協調并調控TECs發育和分化，最終促進胸腺和T細胞的發育。

4 結語

TECs在胸腺微環境中扮演重要角色，cTECs能提供抗原對胸腺細胞進行陽性選擇獲得MHC限制性識別能力，并且mTECs表達自身抗原對胸腺細胞進一步進行陰性選擇，使其獲得中樞免疫耐受。與年齡相關的胸腺退化主要是由TECs缺陷引起的。因此，TECs可作為細胞治療的潛在有效靶點，糾正免疫紊亂及治療自身免疫性疾病，促進TECs增殖，也是恢復衰老個體的胸腺微環境、促進胸腺T細胞再生的最主要的驅動因素。盡管TECs對T細胞發育不可忽視，但是TECs及亞群的發育分化的信號通路及串擾機制還有待更深入研究。TECs發育分化的研究，也必將對臨床中胸腺再生及自身免疫病提供更多有效的治療策略。