去泛素化酶OTULIN研究進展①

胥虹貝 羅 勇 （重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科，重慶400016）

線性泛素化修飾主要由泛素蛋白N末端的甲硫氨酸Met1 的氨基與另一泛素分子C 末端甘氨酸的羧基共價結合而成——甲硫氨酸1-泛素鏈（Met1-Ub）［1］。研究表明，由Sharpin、HOIL-1L和HOIP構成的線性泛素鏈組裝復合體（linear ubiquitin chain as?sembly complex，LUBAC）可對NF-κB 通路中的重要組分NEMO 及NOD2 受體信號通路中的受體相互作用蛋白激酶 2（receptor interacting protein kinase 2，RIPK2）進行線性泛素鏈組裝［2-3］。OTULIN（OTU domain DUB with Linear linkage specificity）作為一種重要的去泛素化酶，可通過S1'泛素結合位點特異性結合Met1-Ub，去除底物蛋白Met1-Ub，在OTULIN相關自身炎癥反應綜合征（OTULIN-related autoin?flammatory syndrome，ORAS）、細胞死亡、血管再生、神經炎癥等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。本文就OTULIN 結構、調節(jié)機制及生物學特性的研究現(xiàn)狀進行概述。

1 OTULIN結構及調節(jié)機制

1.1 OTULIN 與Met1-Ub 人類OTULIN 基因位于染色體5p15.2 區(qū)，通過轉錄翻譯合成含有352 個氨基酸的OTULIN 蛋白［4-5］。晶體結構分析表明，Asn341、His339 和 Cys129 構成 OTULIN 蛋白三級結構的催化中心，其中His339和Cys129通過不同排列方式形成2 種不同構象，具有催化活性的“活化”構象（約30%）主要通過Asn341、His339和Cys129相互作用發(fā)揮作用，而無催化活性的“非活化”構象（約70%）中因Asp336 將His339 從原有催化位置拉出，Cys129發(fā)生轉向從而形成無效的旋轉異構體［5］。

線性泛素化修飾是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型泛素鏈連接方式［1］。研究表明，OTULIN 催化結構域（cat?alytic domain of OTULIN，OTULINcat）的C129位點可與Met1-Ub特異性結合，且OTULIN催化結構域在物種間高度保守［4］。Ub 遠端和近端分別與多個泛素結合位點S1 和S1'連接。S1 位點與遠端Ub 的結合覆蓋面積為1 045?2，且該位點含有與螺旋臂（aa 254～264）相互作用的 Ile44。S1'位點與近端 Ub 的結合覆蓋面積為 880 ?2，主要由 Ub 的 Helix 和 Phe4位點與OTULINcat 的α1 螺旋和α2 螺旋構成。大量S1'泛素結合位點對OTULIN 發(fā)揮去泛素化酶作用至關重要。S1'位點錨定近端Ub，將Met1 指向催化中心。除在空間上與Met-1 很接近的Lys63 外，其他近端Ub 的Lys 殘基均遠離催化中心。OTULIN 通過aa 125～127 和 aa 282～284 形成的 2 個環(huán)將連接點分開。非Met1-Ub 鏈，包括Lys63-Ub 在內的泛素鏈均可在一定程度旋轉近端Ub，使OTULIN S1'位點與非Met1-Ub 鏈無法結合。研究發(fā)現(xiàn)，Lys63-Ub 與OTU?LIN 的結合能力低于Met1-Ub 與OTULIN 結合能力的 1%，Lys48-Ub 與 OTULIN 未檢測到結合，表明OTULIN 的泛素結合點可在一定程度上特異性識別結構非常相似的Met1-Ub 和Lys63-Ub。當Ub 間含有完整的Gly76-Met1鏈序列時，OTULIN 可特異性分解 Ub，OTULIN 對含 Gly76-Met1突變的 tetraUb 無水解性。C129A、H339A 和 N341A 位點突變的 OTULIN也無法分解 Met1-Ub。S1（L259E 和 E314R）或 S1'（W96A 和TQK100-102AAA）位點的點突變可降低OTULIN 對 Met1-Ub 的親和力，從而降低 OTULIN 的去泛素化酶活性［5］。

1.2 LUBAC 與 Met1-Ub LUBAC 最初由 日 本學者KIRISAKO 等［6］提 出 ，認 為 LUBAC 由 HOIL-1L（heme-oxidized IRP2 ligase，RIPK2）或 RBCK1（Ran BP-type and C3HC4-type zinc finger containing 1，RBCK1）、HOIP（HOIL-1L interacting protein）構成，HOIL-1L 和 HOIP 均為含 RING 類結構域的 E3 連接酶，HOIL-1L 與 HOIP 結合可特異性募集 Met1-Ub。TOKUNAGA 等［7］發(fā)現(xiàn)了 LUBAC 另一重要組分——Sharpin（SHANK-associated RH domain interacting protein），Sharpin 的 UBL 結構域可與 HOIP 的 NZF（NPL4 Zinc figer1）結構域相互作用，含 Sharpin 的LUBAC 可對 NF-κB 通路中的重要組分 NEMO 進行線性泛素鏈組裝，從而激活NF-κB信號通路［8-10］。此外，Sharpin 基因無意義突變可導致小鼠慢性增生性皮炎，癥狀類似于X 連鎖高IgM 綜合征和低水腫外胚層發(fā)育不良的表現(xiàn)［11-12］。HOIP 對維持 LUBAC 活性至關重要，研究表明，僅有Met1-Ub富集不足以進一步激活 NF-κB 信號通路［5］。LUBAC 中僅 HOIP 可募集Met1-Ub，也是激活NF-κB 信號通路的先決條件。因此，LUBAC 被重新定義為包含Sharpin、HOIL-1L和HOIP的復合體［9］。

1.3 OTULIN 活性調節(jié)對 LUBAC 募集 Met1-Ub 的影響 OTULIN 通過保守的PIM 結構域與HOIP 的PUB 結構域特異性結合，該結合依賴于OTULIN 的Tyr56和 HOIP的 Asn102［13］。共表達 OTULIN 可抑制HOIP 泛素 化，表明 OTULIN 也 可 抑制 LUBAC 中HOIP 自身泛素化過程，對 OTULIN 拮抗 LUBAC 誘導的 NF-κB 激活至關重要［5，14］。OTULIN PIM 結構域中Tyr56 磷酸化可抑制OTULIN 與HOIP 結合，在一定程度上調節(jié)OTULIN 的去泛素化酶作用［14］。此外，生理條件下，非磷酸化OTULIN參與調節(jié)LUBAC募集Met1-Ub 過程，而磷酸化OTULIN 可通過抑制HOIP與OTULIN結合影響線性泛素鏈組裝［5，14-16］。

ZHOU 等［17］在 1 個巴基斯坦和 2 個土耳其家譜中發(fā)現(xiàn)，含 OTULIN 錯義突變（p. Leu272Pro 和 p.Tyr244Cys）和移碼突變（Gly174Aspfs*2）的4 個患兒出現(xiàn)不同程度發(fā)熱、中性粒細胞性皮炎/脂膜炎、生長發(fā)育受限、關節(jié)痛、進行性脂肪代謝障礙等癥狀，對TNF 抑制劑（英夫利昔單抗）和類固醇具有不同反應。值得注意的是，OTULIN 的3種基因突變并不影響 OTULIN 與 LUBAC 結合，OTULIN N 末端結構域對 OTULIN 與 LUBAC 的結合是必需的［17］。僅轉染p.Leu272Pro和p.Gly174Aspfs*2過表達的質粒無法有效抑制HEK293 細胞內NF-κB 信號通路活性，表明p. Leu272Pro 和p. Gly174Aspfs*2 突變可影響OTULIN 的去泛素化活性，而p. Tyr244Cys 突變對OTULIN 酶活性無影響。患者成纖維細胞和外周血單核細胞內NF-κB 和MAPK 信號通路被明顯激活，OTULIN 靶蛋白 NEMO、TNFR1、RIPK1 和 ASC 蛋白Met1-Ub 含量明顯增多。DAMGAARD 等［18］發(fā)現(xiàn)，B細胞或者T 細胞OTULIN 基因敲除小鼠HOIP 和Sharpin 含量明顯降低，HOIL-1 表達無明顯變化，而骨髓細胞OTULIN 基因敲除小鼠HOIL-1 和HOIP 無明顯改變，Sharpin 輕微降低，表明 OTULIN 對 LU?BAC 各組分表達影響不同，可能與調控的細胞類型有關，具體機制有待進一步研究。

1.4 OTULIN 與 NF-κB 信號通路 研究發(fā)現(xiàn)，OTU?LIN 可阻斷 LUBAC 形成 Met1-Ub 從而抑制 NF-κB 信號通路激活［5，15，19-20］。OTULIN 缺失可導致包括 LU?BAC 在內的多種Met1-Ub 泛素化蛋白累積，但對TNF 誘導的HOIP 至TNFR1 這一過程無影響。但OTULIN 異位表達導致 TNF 誘導的 NF-κB 和相關促炎信號轉導通路激活延遲［5，15］。TNFR1 信號傳導通路中，OTULIN 分解 Met1-Ub 可抑制 NEMO 與 RIPK1結合［5］。OTULIN C129A 突變可導致 OUTLIN 催化活性喪失，但仍可導致體內NF-κB 活化程度降低，推測可能與突變的OTULIN 仍可結合泛素從而發(fā)揮負調節(jié)效應有關［5］。ZHAO 等［13］蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，OTULIN 除與LUBAC 相互作用外，還參與TRIM32蛋白（tripartite motif-containing protein 32）介導的 NF-κB 信號通路，TRIM32 可通過 OTULIN 非去泛素化作用抑制OTULIN 與LUBAC 結合，TRIM32將K63-泛素鏈結合至OTULIN，阻斷OTULIN 與HOIP 的相互作用，從而激活NF-κB 通路。因此，OTULIN 可多途徑調控 NF-κB 信號通路，具體調控機制有待進一步研究。

1.5 OTULIN 與NOD2受體信號通路 細胞內PRR核苷酸寡聚化結構域蛋白2（nucleotide oligomeriza?tion domain containing protein 2，NOD2）可識別細菌肽聚糖的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）成分，各種病理刺激下，NOD2 與RIPK2 結合，募集細胞凋亡抑制劑（IAP）家族的Ub 連接酶［21］。研究發(fā)現(xiàn)，OTULIN 參與調節(jié)NOD2 受體信號通路。NOD2刺激可促進LUBAC 募集Met1-Ub 對RIPK2 進行線性泛素鏈組裝［22］。OTULIN 沉默可致 RIPK2 蛋白的Met1-Ub 含量 增 高 ，與 NEMO 和 RIPK2 結合增多、NF-κB 信號通路激活增強有關，反之，OTULIN 過表達可抑制RIPK2蛋白Met1泛素化［15］。OTULIN 可限制RIPK2 蛋白Met1-Ub 組裝速度并持續(xù)分解LU?BAC募集的Met1-Ub，少量配體刺激NOD2時該現(xiàn)象尤為顯著，此外，NOD2和TNFR1刺激可導致受體組分Met1-Ub 混雜，該作用可被內源性OTULIN 抵消，LUBAC和OTULIN持平的活性作用可以解釋為什么Met1-Ub在細胞中處于極低水平以及過表達LUBAC并不會明顯促進Met1-Ub 在細胞內的富集，盡管有研究發(fā)現(xiàn)離體條件下LUBAC 可明顯促進Ub 鏈組裝［6，23］。DRABER 等［24］研究認為，OTULIN 未被招募至TNFR1 信號復合物，其主要通過調節(jié)細胞胞質LUBAC 復合體組分的Met1 泛素化水平，而不是調節(jié)RIPK1 和NEMO 等信號復合物自身的Met1 泛素化。但 WAGNER 等［25］發(fā)現(xiàn)，當 TNF 刺激后，TNFR1復合物存在低水平內源性OTULIN 表達，OTULIN 參與調節(jié) NOD2 受體復合物中 RIPK2 的泛素化［3，15］。因此，OTULIN對受體信號復合物如TNFR1和NOD2的作用尚不明確。

2 OTULIN生物學特性

2.1 OTULIN 與細胞死亡 研究表明，OTULIN 過表達可抑制poly（I：C）誘導的NF-κB 信號通路激活。過表達OTULIN，經10 ng/ml TNF-α誘導的NF-κB靶基因轉錄水平降低。無OTULIN 過表達的細胞在TNF-α 刺激后15 min，細胞內IκBα 迅速發(fā)生磷酸化及降解，但過表達OTULIN 的細胞內 NF-κB 信號通路激活明顯延遲［5］。OTULIN 過表達導致 TNF-α 誘導的細胞死亡敏感性降低，與Sharpin 缺失的cpdm小 鼠 及 HOIL-1 突 變 的 人 類 中 結 果 一 致［7-9，26-27］。KEUSEKOTTEN 等［5］發(fā)現(xiàn)，OTULIN 過表達可誘導細胞晚期JNK信號通路激活和c-Jun磷酸化，從而導致誘導細胞死亡的2 大分子PARP 和caspase-3 被剪切，HEK 293ET 和 U2OS 細胞中，敲除 OTULIN 基因可進一步增強poly（I：C）和TNF-α 誘導的細胞因子產生和 NF-κB 信號通路激活。TNF-α 刺激后早期IκBα 被輕度磷酸化和降解，晚期 JNK 和 c-Jun 持續(xù)磷酸化，促進細胞死亡。此外，RUNE BUSK DAMGAARD 等［20］發(fā)現(xiàn)，OTULIN 缺乏導致成纖維細胞和單核細胞對TNF 誘導的細胞死亡更加敏感。KEUSEKOTTEN 等［5］認為 OTULIN 過表達和敲除均可導致細胞死亡，具體機制有待進一步探索。

2.2 OTULIN 與ORAS ORAS也被稱為otulipenia，主要由DUB 的OTU 結構域的純合錯義（p.L272P 和p. Y244C）和 移碼 突變（p. G174Dfs*2）產生［18］。DAMGAARD 等［18］最初發(fā)現(xiàn) 3 個具有血緣關系的早產兒均表現(xiàn)出特發(fā)性炎癥表型，嬰兒在出生后即出現(xiàn)反復腹瀉、血清高C反應蛋白、高白細胞和中性粒細胞等全身炎癥反應，最后均進展為復發(fā)性結節(jié)性脂膜炎，并伴有不同程度中性粒細胞浸潤、復發(fā)性發(fā)熱、生長發(fā)育不良、關節(jié)疼痛腫脹及血清免疫球蛋白和自身抗體水平升高等。p. Y244C 和p.G174Dfs*2 突變患者體內 NF-κB、JAK/STAT 和 TNF信號通路被激活，激活程度與采樣時患者癥狀嚴重程度呈正相關，此外，不同患者細胞內OTULIN 蛋白差異表達，OTULIN 含量與體內 NF-κB 信號激活程度呈負相關，此外，OTULIN 基因突變患者細胞內Met1-Ub 水平明顯上升。英夫利昔單抗（Infliximab）可明顯改善患者癥狀，降低外周血C 反應蛋白、白細胞和中性粒細胞含量至正常水平［18］。

2019年，DAMGAARD等［20］發(fā)現(xiàn)1例出生即出現(xiàn)嚴重全身炎癥反應的阿拉伯女嬰，全外顯子組測序提示該患兒OTULIN 發(fā)生純合子單堿基替換，即c. 841g>a，p. Gly 281 Arg。與 Leu272 和 Tyr244 相似，Gly281位于OUT 結構域，是位于螺旋α11和α12環(huán)上的保守位點。Gly28 與His282、Thr283 共同構成泛素結合位點，穿過活化位點直接與M1-Ub 遠端結合。晶體結構分析發(fā)現(xiàn)，含Gly281Arg ORAS 突變的 OTULIN 催化結構域（OTULINcatG281R）采用類似OTULINcatWT的OTU 折疊方式，但引入的Arg 側鏈無法裝配于螺旋α3 和α9 間的狹窄口袋中，從而將GLy281 環(huán)從正常結合槽中翻轉出來。對突變的OTULIN蛋白進行跨環(huán)高晶體學B因子分布分析，結果提示，與OUT 結構域內的其他區(qū)域相比，突變后的環(huán)柔韌性增強，從而影響M1-Ub 結合位點阻止底物結合，降低OTULIN 水解M1-Ub 活性。同OTU?LINC129A位 點 85 nmol/L 的 解 離 常 數 相 比 ，OTU?LINC129A/G281R與 M1-Ub 解 離 常 數 為 9.3 μmol/L。OTULING281R對M1-Ub 的水解活性低于OTULINcatWT的1/20～1/200。OTULING281R患者成纖維細胞中蓄積大量M1-Ub，且TNF-RSC 信號通路明顯受損，此外，OTULIN 缺乏的人單核細胞內 NF-κB 信號通路被激活，TNF 分泌增多。DAMGAARD 等［20］發(fā)現(xiàn)，造血干細胞移植術可完全緩解患兒ORAS 相關癥狀，為該突變類型的ORAS 患者提供有效治療方案。此外，NABAVI等［28］2019年也報道了一種新的OTULIN致病性變異體，即由OTULIN純合子c.864+2 T>C突變（NM_138348）所致的全身炎癥反應并導致患者死亡，晶體結構分析提示，突變的OTULIN 蛋白結構不穩(wěn)定，且去泛素化酶活性明顯降低。

OTULIN 在T 細胞、B 細胞和自然殺傷細胞中均有表達，在樹突狀細胞和巨噬細胞中含量尤為豐富。OTULIN 敲除小鼠表現(xiàn)出早發(fā)的嚴重全身炎癥反應，體重明顯下降，血清促炎細胞因子尤其是TNF、G-CSF 和IL-6 含量顯著增多，中性粒細胞增多，組織內大量中性粒細胞浸潤。OTULIN 發(fā)揮抗炎效應具有細胞特異性，T 細胞或B 細胞OTULIN 敲除小鼠無明顯炎癥表型，而骨髓細胞OTULIN 導致小鼠（LysMCre-OTULINLacZ/flox）出現(xiàn)嚴重的急性全身炎癥反應，體內淋巴器官和肝臟明顯腫大，外周血白細胞明顯增多，以中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞增多為主［18］。雖然 DAMGAARD 等［18］發(fā)現(xiàn) B 細胞和T 細胞OTULIN 沉默對小鼠體內Met1-Ub 募集無明顯影響，但另有研究報道T 細胞和B 細胞參與Met1-Ub 募集過程［29-32］。因此，OTULIN 調節(jié) B 細胞和T細胞內Met1-Ub的可能作用尚未明確。

2.3 OTULIN 與血管再生 OTULIN 基因突變與胚胎中時期血管形成缺陷密切相關。DAMGAARD等［19］發(fā)現(xiàn)，OTULIN 基因 336 位 Asp 突變?yōu)?Glu，可導致突變小鼠在胚胎期第12.5～14 d 死亡，突變小鼠頭及軀干血管分支網絡形成障礙、血管排列紊亂，在胚胎頭部的中間區(qū)域，多個大直徑腦血管分支形成分層血管網絡，大的顱內血管擴張，血管分支減少，內皮細胞在分叉處聚集，OTULIN 可與Dishev?eled-2 蛋白（DVL2）結合，參與調節(jié)經典的Wnt 信號通路，對胚胎時期血管形成發(fā)揮重要作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，染色體5p15.2 位點基因丟失導致的人OTULIN 合成障礙可導致精神發(fā)育遲滯、神經及顱面發(fā)育畸形［33-35］。

2.4 OTULIN 與缺血性腦血管疾病 目前OTULIN在中樞神經系統(tǒng)（CNS）中的研究較少，僅在腦血管疾病中有報道。XU 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，局灶腦缺血/再灌注損傷可誘導大腦內源性OTULIN 表達增多，且上調的OTULIN 富集于活化的小膠質細胞。過表達OTULIN 具有神經保護、減輕小膠質細胞介導的神經炎癥反應的作用，該效應與腦內NF-κB 信號通路被抑制有關。鑒于OTULIN 參與外周免疫細胞及CNS 免疫細胞介導的炎癥反應，對NF-κB 信號通路發(fā)揮重要的負性調節(jié)作用，推測OTULIN 可能對CNS 其他相關疾病發(fā)揮作用，是極具研究意義的靶點。

3 展望

OTULIN 作為一種新型的可特異性水解Met-Ub的去泛素化酶，參與包括細胞死亡、炎癥反應和血管生成等多個重要的生理過程。但目前關于其去泛素化的具體機制研究較少，仍然存在許多需進一步探索的問題，比如OTULIN 對LUBAC 各組分表達影響的機制，磷酸化OTULIN是如何影響OTULIN的去泛素化效應？大量細胞研究證實OTULIN 可通過抑制NF-κB 信號激活從而有效減輕炎癥反應，那是否OTULIN 參與調控減輕諸多由NF-κB 信號激活介導的疾病炎癥損傷呢？因其強大的負性調控NF-κB信號通路，減輕炎癥性損傷的效應，OTULIN 是一種有價值的、值得深入研究的去泛素化酶，有待成為一種新的治療靶點。