艱難梭菌感染與腸道微生態(tài)的研究進展

王曉亞，安彥波，戴敏高，趙麗娜，劉軍肖，牛占叢

1 艱難梭菌與腸道微生態(tài)概述

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是一種嚴格厭氧的革蘭陽性芽孢桿菌[1]，但它可以在有氧環(huán)境中存活。艱難梭菌定植于3%的健康成人和近80%的健康新生兒及嬰兒的腸道中，它屬于條件致病菌, 正常腸道菌群可以抵抗艱難梭菌的定殖和過度生長，而在長期大量使用抗生素的患者或其他免疫力低下的人群中，艱難梭菌會過度增殖并釋放毒素，引起以腸道病理損傷為主的感染性疾病，即艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection,CDI)[2]。艱難梭菌是引起抗生素相關(guān)腹瀉的最主要病原菌，可引起一系列疾病，如腹瀉、暴發(fā)性結(jié)腸炎、假膜性結(jié)腸炎、中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔、膿毒癥和多器官功能障礙，是醫(yī)院內(nèi)獲得性細菌感染及胃腸炎癥相關(guān)死因的首要原因，嚴重威脅住院患者的健康[3-4]，據(jù)報道，艱難梭菌感染病死率可高達6.9%～16.7%[5]。高毒力的艱難梭菌菌株(BI/NAP1/027型)[6]進一步加劇了這一問題，使得艱難梭菌感染引起了更多的關(guān)注,該型菌株可引起暴發(fā)型結(jié)腸炎，病情進展迅速，病死率高，預后差。在過去的十年中，由于與艱難梭菌感染相關(guān)的發(fā)病率、死亡率和醫(yī)療費用的增加，艱難梭菌受到了新的關(guān)注[7]。

腸道微生態(tài)包含腸道微生物及其代謝產(chǎn)物。人體內(nèi)的微生物數(shù)量至少和人體細胞的數(shù)量一樣多[8]，這些微生物可存在于人體所有的粘膜部位。腸道是微生物數(shù)量最豐富的器官，由1 000多個不同的細菌種類組成，其編碼的基因數(shù)量是人體自身基因數(shù)量的數(shù)百倍，腸道菌群的總質(zhì)量可達1.5 kg[9-10]。腸道微生物分布廣泛、數(shù)量龐大，人體腸道內(nèi)定居著約一百萬億個微生物，并且其基因組含有參與膽汁酸代謝、碳水化合物發(fā)酵、氨基酸代謝等基因，在人體作用機制復雜，參與人體的多種生理及病理過程。腸道微生物與多種代謝、內(nèi)分泌、自身免疫和炎癥性疾病有關(guān)，并參與物質(zhì)代謝和營養(yǎng)合成[9-13]。了解腸道微生態(tài)的改變與艱難梭菌之間的聯(lián)系有望確定新的治療策略和生物標志物，從而預測治療結(jié)果并提高診斷水平。

2 艱難梭菌致病機制

艱難梭菌在人體腸道內(nèi)定植主要分為產(chǎn)毒型菌株和非產(chǎn)毒型菌株，而產(chǎn)生致病作用的主要是產(chǎn)毒型菌株。艱難梭菌在腸道內(nèi)增殖并分泌毒素A(toxin A,TcdA)和毒素B(toxin B,TcdB)兩種毒素，TcdA是一種腸毒素，也有一定的細胞毒性作用，TcdB是一種細胞毒素，毒素B的毒力較毒素A強10倍[14-16]，毒素激活腸道宿主免疫，使中性粒細胞增加，并產(chǎn)生殺菌活性氧中間體、防御素、促炎細胞因子和趨化因子[17]，導致強烈的炎癥反應。這些毒素還通過多種通路與腸道上皮細胞表面受體結(jié)合，轉(zhuǎn)運到胞漿，然后修飾Rho、Ras和Rap亞家族的小分子GTP酶，通過這一作用破壞腸道上皮肌動蛋白骨架和緊密連接[18]，使真核細胞骨架崩潰，并對腸上皮細胞產(chǎn)生細胞毒作用，引起結(jié)腸炎癥等一系列病變。有些毒株還會產(chǎn)生由染色體上致病性決定區(qū)外的基因cdt A、cdt B編碼的二元毒素[19]，從而使艱難梭菌毒力進一步增強。CDI 發(fā)病率和嚴重程度的增加在很大程度上歸因于一種新的艱難梭菌毒株的出現(xiàn)，即 BI/NAP1/027[20]，該菌株中TcdA和TcdB的產(chǎn)生增加，存在二元毒素，同時發(fā)現(xiàn)一種重要毒素產(chǎn)生下調(diào)基因 tcd C的缺失，可能有助于艱難梭菌毒性增加[6]。

腸道微生態(tài)紊亂是艱難梭菌致病的另一個潛在因素。腸道微生態(tài)紊亂可能通過膽汁酸代謝、氨基酸代謝、碳水化合物發(fā)酵物等代謝物來增加艱難梭菌的致病性。腸道微生物對膳食纖維進行厭氧發(fā)酵會產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)，當SCFAs濃度下降時，pH升高，從而產(chǎn)生有利于艱難梭菌生長的環(huán)境[21]。初級膽汁酸可以促使艱難梭菌芽孢萌發(fā)[22]。另外一些研究表明，艱難梭菌的非毒素分子，特別是S層蛋白 (S-layer protein, SLP)，具有免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明艱難梭菌外蛋白質(zhì)組組成與艱難梭菌基因型相關(guān)，某些菌株分泌的特定蛋白質(zhì)可能與TcdA和TcdB的毒力增效有協(xié)同作用，生化分析表明，一種基因型為ST54_NAPCR1的菌株分泌的S層蛋白A(S-layer proteinA, SlpA)比其他菌株多，此外，ST54_NAPCR1菌株的SLpA具有較強的促炎活性[23-24]。

3 艱難梭菌感染的高危因素

多種危險因素可以導致CDI，關(guān)于CDI的危險因素的研究日益增多，但結(jié)論不盡相同，主要包括長時間住院、年齡大于65歲、免疫功能低下、使用抗生素治療和應用質(zhì)子泵抑制劑等[23,25]。CDI的危險因素與腸道微生態(tài)的改變有關(guān)。

3.1 抗生素 艱難梭菌感染通常與抗生素引起的正常腸道微生物區(qū)系多樣性喪失有關(guān)。正常情況下，腸道微生態(tài)在維持健康人體新陳代謝，免疫防御方面起重要作用[26]。引起艱難梭菌感染的抗生素，幾乎涵蓋了所有的種類，尤以第三代頭孢菌素、廣譜青霉素、碳青霉烯類等廣譜抗生素居多[27-29]。同時，CDI 的發(fā)生風險取決于抗生素使用的頻率、持續(xù)時間、抗生素的給藥方式和使用藥物的劑型[30]。不同種抗生素產(chǎn)生了獨特的腸道微生物群落，增加一些促進艱難梭菌生長底物的濃度，例如初級膽汁酸以及生長所需的甘露醇、果糖、山梨醇、棉子糖和水蘇糖等碳源使艱難梭菌得以定植[22, 31-32]。與健康人相比，接受抗生素治療的人的腸道微生物態(tài)顯示出微生物多樣性、均勻性和豐富度降低。抗生素會改變腸道菌群的組成，包括腸桿菌科豐度增加和毛螺菌科、瘤胃球菌科、雙歧桿菌豐度的降低，影響微生物代謝，使艱難梭菌等增加[33]。另外，抗生素的使用會改變微生物的結(jié)構(gòu)和膽汁酸的代謝，進一步啟動艱難梭菌芽孢的萌發(fā)。此外，免疫系統(tǒng)和腸道微生物群之間信號通路的改變也可能導致抗生素暴露后對CDI的易感性增加。

3.2 年齡 腸道正常菌群是一種重要的天然防御機制，可抑制艱難梭菌的生長。多項臨床數(shù)據(jù)分析提示年齡是CDI的獨立危險因素[34-35]。老年人常合并基礎(chǔ)疾病、既往抗菌藥物史、自身免疫力和抵抗力降低等，故抵抗 CDI 的能力也明顯下降。年齡大于65歲的老年人，尤其是既往長期住院或長期處于療養(yǎng)院等醫(yī)療機構(gòu)的老年人應該高度警惕CDI的發(fā)生。

3.3 質(zhì)子泵抑制劑 使用藥物(質(zhì)子泵抑制劑，PPIs)抑制胃酸的產(chǎn)生也會增加艱難梭菌感染的風險。PPIs可以抑制胃酸的分泌，導致胃內(nèi)pH升高、胃酸保護屏障破壞，引起胃腸道系統(tǒng)的各類不良反應，更加有利于艱難梭菌的定植。多系統(tǒng)評價表明,PPI的大量使用可以引起腸道微生態(tài)紊亂，誘發(fā)艱難梭菌感染[27, 36-37]。并且研究表明CDI的風險具有劑量依賴性[37]。因此，臨床上應該注意PPIs的適應癥和使用劑量，以降低CDI風險。

4 腸道微生態(tài)的定植抗性

腸道微生態(tài)失調(diào)會導致機體抵抗艱難梭菌感染的屏障被破壞，同時艱難梭菌感染也會導致腸道微生態(tài)紊亂，進而使腸道屏障功能下降甚至喪失，在腸道菌群被抑制的人群中細菌很容易定居并繁殖成為優(yōu)勢菌群。腸道菌群主要分為4個菌門:厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，健康的腸道微生物群主要以厚壁菌門及擬桿菌門為優(yōu)勢菌門。艱難梭菌感染等因素可以破壞宿主腸道屏障和腸道菌群結(jié)構(gòu)，尤其是降低厚壁菌門和擬桿菌門的豐度。基因組分析顯示，艱難梭菌感染后腸道微生態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為物種多樣性和豐富度顯著下降，主要是擬桿菌門的擬桿菌科和厚壁菌門(Firmicutes)的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)減少[38]。腸道中可用于艱難梭菌萌發(fā)和生長的代謝物，主要受到厚壁菌門和擬桿菌門兩個優(yōu)勢門的強烈影響[22]。

腸道微生態(tài)的平衡和穩(wěn)態(tài)有助于宿主抵抗細菌、病毒和真菌感染，即定植抗性。腸道微生態(tài)定植抗性的機制主要包括以下4個方面。一是腸道菌群與病原體營養(yǎng)和空間競爭：細菌等病原體為了在腸道中定居，必須與高度適應腸道環(huán)境的腸道微生物群爭奪相同的營養(yǎng)源。腸道微生物競爭性消耗和利用某些單糖等營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制艱難梭菌等病原體的繁殖。二是腸道微生物分泌抑菌或殺菌的小分子從而抑制致病菌定植：腸道微生物群某些菌株可以產(chǎn)生和分泌具有抑菌或殺菌活性的小分子，如內(nèi)源性抗菌肽類物質(zhì)、細菌素和溶菌酶等[39]。當艱難梭菌進入人體后，腸道內(nèi)的抗菌肽類物質(zhì)發(fā)揮抗菌作用。但同時，一些病原菌也可以通過此種方式影響腸道菌群從而在腸道內(nèi)定植。三是腸道微生物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物抑制病原體的生長：如次級膽汁酸、SCFAs、氨基酸等代謝產(chǎn)物[40-42]。SCFAs可以通過影響細胞內(nèi)的pH和代謝功能來抵抗病原菌的生長，且短鏈脂肪酸的濃度與腸道pH值呈負相關(guān)，另外，SCFAs等代謝副產(chǎn)物激活免疫反應，從而影響全身免疫應答[9]。琥珀酸是腸道微生物碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸，是腸道中的一種重要中間代謝物，可促進體內(nèi)艱難梭菌的感染[43-44]。在健康的腸道微生態(tài)中，初級膽汁酸鵝脫氧膽酸、次級膽汁酸脫氧膽酸和石膽酸能抑制艱難梭菌在大腸內(nèi)的孢子萌發(fā)和生長。然而，抗生素的使用會改變微生物的結(jié)構(gòu)和膽汁酸的代謝。一項在小鼠腸道進行抗生素誘導的實驗表明，抗生素誘導后引起小鼠腸道微生物群和代謝組的改變，腸道內(nèi)初級膽汁酸在腸道微生物產(chǎn)物作用下脫羥基轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸[45]，從而有利于艱難梭菌的生長，同時促進艱難梭菌孢子的萌發(fā)，增加了CDI的易感性。甘氨酸與某些膽汁酸結(jié)合可促進艱難梭菌的萌發(fā)。組氨酸含量的增加與艱難梭菌陽性的患者樣本有關(guān)，此外，抗生素敏感小鼠盲腸內(nèi)容物中N-乙酰化甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸增加，而N-乙酰化天冬氨酸減少[46]。四是腸道微生物可增強免疫應答抵抗病原菌定植：腸道微生物對于多種免疫細胞的發(fā)育和功能是必不可少的，腸道微生物群可以對腸道免疫細胞群產(chǎn)生局部和全身性影響，包括影響固有淋巴細胞(innate lymphoid cells,ILCs)和Th17(T helper 17 cells)產(chǎn)生細胞因子、調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)的分化、激活中性粒細胞、誘導IgG反應等[10, 47-48]。Chen等實驗展示了由γδT細胞產(chǎn)生的IL-17A在抵抗艱難梭菌感染的宿主防御中的重要作用[49]。動物實驗證實給小鼠直腸注射純化蛋白SlpA可引起全身性和局部性體液免疫反應，產(chǎn)生IgG和IgA抗體，能減少艱難梭菌在小鼠腸道中定植[50]。

5 艱難梭菌感染的治療

大多數(shù)的艱難梭菌感染是由使用抗菌藥物后健康的腸道菌群紊亂引起的，CDI 治療的首要原則是盡早停止目前正在使用的的抗菌藥物，其次是口服有效治療藥物。目前臨床上用于治療 CDI 的藥物主要包括甲硝唑、萬古霉素、非達霉素等。CDI治療的基石最近由甲硝唑和萬古霉素改為萬古霉素和非達霉素。

有研究表明益生菌在預防原發(fā)性CDI方面有積極作用。然而，這些研究在益生菌的劑量和類型、艱難梭菌菌株、抗生素的劑量和類型以及治療的時機方面有很大的不同。

歐洲[51]和美國[52]的CDI防治指南均建議對于復發(fā)性和難治性CDI，經(jīng)常規(guī)治療無效后可以考慮糞便菌群移植(Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)治療，以恢復患者腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減少艱難梭菌定植。發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學雜志》上的一篇文章報道了與接受萬古霉素治療相比，經(jīng)十二指腸FMT治療復發(fā)性CDI的成功率為80%[53]。FMT是治療CDI的一種高效方法[54]，已被證明能誘導微生物區(qū)系恢復。移植的正常的腸道菌群可以競爭性抑制艱難梭菌的生長，同時產(chǎn)生氨基酸、SCFAs、次級膽汁酸等代謝物，從而抑制艱難梭菌的定植和生長。研究證明FMT后丁酸、乙酸和丙酸等短鏈脂肪酸的水平持續(xù)升高，脫氧膽酸和石膽酸等次級膽汁酸隨時間變化有不同的恢復。這些增加的代謝物與毛螺菌科、瘤胃菌科和未分類的梭菌屬的細菌有關(guān)，而初級膽汁酸與這些菌群呈負相關(guān)[55]。Weingarden等描述了糞便膽汁酸成分調(diào)節(jié)CDI的有力證據(jù)，患者進行FMT前的樣本中缺乏石膽酸、脫氧膽酸等次級膽汁酸，而進行FMT后捐贈者的樣本中膽酸和鵝脫氧膽酸等初級膽汁酸顯著減少[56]。類似地，Allegretti等研究發(fā)現(xiàn)，與來自健康對照組的樣本相比，初發(fā)和復發(fā)CDI患者的樣本中初級膽汁酸水平顯著升高，次級膽汁酸水平顯著降低。他們還指出，與初發(fā)CDI患者的樣本相比，復發(fā)病例的樣本中初級膽汁酸顯著升高[57]。FMT已被證明是治療復發(fā)性CDI最有效的方法。然而，由于受實際情況及道德倫理影響并不是所有的患者都可以進行FMT治療。

6 艱難梭菌感染的預防

艱難梭菌通過糞-口途徑傳播，通常住院患者艱難梭菌的攜帶率為7%～11%。許多艱難梭菌感染患者在治療成功后成為無癥狀攜帶者，并通過孢子在宿主之間傳播[58]，預防CDI最重要的是合理的使用抗生素和控制感染途徑[59]。特別是在艱難梭菌感染暴發(fā)期間，減少艱難梭菌的傳播需要嚴格遵守接觸預防措施，原因不明的腹瀉患者需要進行隔離。醫(yī)護人員都應采取手部衛(wèi)生和物理防護措施，包括戴手套和穿防護服。艱難梭菌芽孢對消毒劑如乙醇、高溫、紫外線等有較強的抵抗性，酒精不能殺死艱難梭菌的孢子[60]，可以在物體表面存在數(shù)月到數(shù)年，從而在人群中傳播。用肥皂水洗手比使用酒精擦手更有效地清除艱難梭菌。因此，建議先用肥皂和水洗手，然后用含酒精的洗手液消毒，使用具有滅孢子功能的產(chǎn)品進行環(huán)境消毒，例如稀釋次氯酸鈉(家用漂白劑)[52]。

一些研究提出益生菌可作為艱難梭菌高危人群預防性治療[61-62]，但目前的研究仍存在爭議，沒有足夠的數(shù)據(jù)，建議在臨床實驗之外使用益生菌作為CDI的預防。在益生菌被納入預防措施之前，迫切需要專門研究確定益生菌是否有效，以及確定哪種類型的細菌、劑量和服藥時間可以降低CDI的風險。因此，關(guān)于艱難梭菌的防治指南中并未明確將益生菌作為預防感染的方法。益生元可以被腸道微生物選擇性利用，產(chǎn)生對人體有益的物質(zhì)，降低艱難梭菌在腸道的定植。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)水蘇糖能夠改善腸道微生物豐富度，多形擬桿菌回復部分膽汁酸水平，兩者選擇性地改變了某些菌種的相對豐度[63]。隨著人們對腸道微生態(tài)研究的進一步認識，未來腸道微生態(tài)及其代謝物和免疫因子可能會成為預防CDI的突破口。

7 結(jié) 語

艱難梭菌感染與腸道微生態(tài)紊亂互為因果，正常的腸道菌群是機體抵抗艱難梭菌的主要保護屏障。艱難梭菌感染嚴重威脅患者健康，臨床上控制艱難梭菌感染途徑和合理應用藥物對于防治艱難梭菌感染至關(guān)重要。