基孔肯雅病毒小鼠感染模型研究進展

蔣小武，朱樂欣，艾莎珍

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)屬于披膜病毒科病毒，是一種主要經伊蚊叮咬而傳播的蟲媒病毒[1]。該病毒顆粒直徑約65 nm，具有20面體衣殼，基因組大小約11.8 kb，含兩個主要的開放閱讀框，其中靠近5′端的ORF編碼4種非結構蛋白(nsP1- nsP4)，靠近3′端的編碼3種結構蛋白(衣殼蛋白C，兩個包膜糖蛋白E1和E2)和2種小肽(E3和6K)[2-3]。CHIKV流行毒株分為亞洲(Asia)型、西非(WA)型、東中南非(ECSA)型和印度洋(IOL)型4個遺傳譜系[1,4]。CHIKV有城市(urban)和森林(sylvatic)兩種不同的循環模式進行傳播擴散，其中城市感染模式由人類被蚊媒叮咬再傳染人類，而森林模式則從非人靈長類動物起始傳給蚊媒再傳給人類。Sylvatic模式傳播的CHIKV主要局限于于非洲森林的伊蚊和非人靈長類動物體內，流行性和感染規模有限。大部分CHIKV感染暴發病例均為城市傳播模式，埃及伊蚊和白紋伊蚊作為重要的傳播媒介，極易在人群密集的地方引發基孔肯雅熱疫情[5-6]。不同流行毒株基因組變異，尤其是囊膜蛋白或非結構蛋白某些位點的突變，會提高CHIKV對伊蚊的適應性，增強病毒復制與傳播能力[2]。

人類感染基孔肯雅病毒可以發生基孔肯雅熱(Chikungunya fever，CHIKF)。CHIKF的典型癥狀是急性發熱與嚴重關節痛，具體表現為多關節痛、關節炎、腱鞘炎、肌痛、頭痛和皮疹，關節疼痛位置一般對稱性的分布于手臂和腿部。該病致死率較低，急性感染患者7～10 d內癥狀自行消退，但30%以上的患者會發展為慢性感染，出現持續性的關節腫脹和肌肉疼痛，疼痛和炎癥反應可持續數月至10年之久，嚴重降低患者生活質量[7-9]。自1952年首次在坦桑尼亞南部地區發現基孔肯雅病毒以來，CHIKF多次在非洲、美洲、拉丁美洲、歐洲、南亞以及東南亞國家暴發，特別是對蚊媒密度較高的熱帶與亞熱帶地區威脅較大[4-5, 10]。我國于1987年首次在云南西雙版納地區發現CHIKF輸入病人，2010年廣東東莞暴發過一次小范圍CHIKV本土感染(10例確診)，國內多個入境口岸先后檢出CHIKV輸入性病例[11-13]。目前，全球已有100多個國家報道出現CHIKF散發或暴發，CHIKV被世界衛生組織認定為可能導致全球嚴重疫情暴發的8種潛在危險病原體及3種次危病原體之一[5,14]。

活體動物感染試驗對探究CHIKV如何在體內復制、侵染與誘發機體病毒血癥，解析宿主抗病毒免疫反應以及開發、評價疫苗或抗病毒藥物的療效等研究至關重要。迄今，已報道的關于CHIKV動物感染模型包括小鼠、非人靈長類動物、倉鼠以及斑馬魚[10,15-17]。非人靈長類動物模型(主要為獼猴)與人類的遺傳進化關系較近，采用該模型感染CHIKV獲取的試驗數據更加貼近真實情況，但獼猴屬于大型動物，實驗材料不易獲取，價格昂貴，需要專門嚴格的飼養環境與管理措施，加之不能完全替代人體的微環境特征，因此應用范圍窄，文獻報道不多。倉鼠與斑馬魚模型個體較小，尤其是斑馬魚作為模式生物，具有通體透明，發育周期短，遺傳背景清晰與實驗操作技術成熟等優點，但是這兩種實驗動物在CHIKV感染試驗研究中的成果不多，結論尚不成熟，還有待進一步論證。目前，小鼠是CHIKV感染研究應用最多的動物模型，其主要優勢在于實驗小鼠遺傳背景清晰，個體大小適宜，品系多樣，成本較低，易于管理，而且和市面上眾多的小鼠相關靶向基因或抗體檢測試劑匹配，特定基因修飾的轉基因小鼠也相對容易獲得。本文旨在詳細論述、匯總分析不同小鼠模型在CHIKV感染研究中的應用及其優缺點，以期增強對CHIKV感染機制的理解，并為其它蚊媒病毒動物模型的開發提供參考。

1 新生幼鼠模型

回顧性隊列分析發現：懷孕母體感染CHIKV引發病毒血癥，其分娩的新生兒CHIKV感染率高達50%，患兒易出現血流異常、心室功能不全、神經系統發育缺陷以及腦膜炎等神經癥狀，死亡風險較高[18-19]。因此，有學者采用新生幼鼠模擬人類感染CHIKV引發致死性腦炎相關表型與機制的研究。Couderc等以106PFU的CHIKV胸腹部皮下接種6 d齡與9 d齡C57BL/6新生幼鼠，結果發現幼鼠對CHIKV易感，感染后3 d即可在幼鼠皮膚、肌肉、血液、肝臟、關節組織及腦內檢出活病毒。6 d齡幼鼠感染CHIKV引發的病毒性腦炎癥狀最為嚴重，所有試驗組幼鼠在12 d內死亡，死亡率達100%[20]。Ziegler等以新生ICR與CD-1幼鼠進行CHIKV感染試驗，結果顯示感染CHIKV的幼鼠出現嗜睡、行走困難、體重增長減緩。新生幼鼠1周內出現病毒血癥，腿部肌肉與腦內也可檢出高滴度的CHIKV，其它癥狀包括骨骼肌局灶性壞死與炎癥反應，但ICR與CD-1幼鼠感染CHIKV病死率明顯低于C57BL/6幼鼠模型[21]。進一步采用新生幼鼠進行CHIKV腦內接種感染試驗，發現該病毒可感染誘導腦內神經元與星形膠質細胞發生內源性凋亡，誘導CD206+等樹突狀先天免疫細胞募集、活化，引發炎癥反應從而導致幼鼠形成腦炎損傷[22]。Zhang等構建了熒光蛋白標記的重組CHIKV病毒，并成功以BALB/c新生幼鼠模型進行了顱內接種試驗，結果顯示重組病毒能在腦內復制并有效侵染幼鼠全身臟器[23]。另外，新生幼鼠作為體內動物試驗模型在抗CHIKV中和抗體與治療藥物有效性檢測方面也有應用。Saraswat等以抗CHIKV高免血清被動免疫新生BALB/c幼鼠，發現幼鼠可以完全抵抗CHIKV的感染[24]。Lam等以新生幼鼠模型驗證了中和CHIKV-E2糖蛋白N218表位的單克隆抗體和拮抗病毒翻譯起始作用的磷酸二氨基酯嗎啉代寡聚物的抗病毒作用[25-26]。上述試驗說明新生幼鼠對CHIKV易感，是CHIKV相對理想的感染、病理與抗病毒藥物功效評估模型，但因其免疫系統發育不成熟，感染CHIKV易引發致死性腦膜炎并迅速死亡等特征，極大地限制了其在CHIKV誘發更大范圍的輕、中癥與急、慢性肌肉關節炎等疾病表型的致病機理、宿主抗炎與激活機體免疫反應機制等方面的應用。

2 成年野生實驗小鼠模型

人感染CHIKV的主要癥狀表現為急、慢性肌肉腫脹、疼痛與關節炎，患者中出現持久性的病毒檢出與炎癥因子釋放的比例越來越高，但關于CHIKV如何引發肌肉疼痛與關節炎癥的機理仍不清楚[27]。有學者模仿蚊蟲叮咬模式，采用足墊皮下方式將CHIKV接種至野生型成年C57BL/6小鼠體內，發現CHIKV感染小鼠足部致腳踝腫脹，并伴有關節炎、腱鞘炎、肌痛和骨膜炎等典型臨床癥狀。CHIKV在小鼠足部關節內大量復制，并引發持續性病毒血癥[28-30]。這與人感染CHIKV的常見疾病表型基本吻合，暗示成年野生型實驗小鼠可能適合作為動物模型用于模擬、探索人感染CHIKV典型表型與潛在機制。比較分析不同野生型實驗小鼠(C57BL/6、ICR、CD-1、WT 129和DBA / 1J)對CHIKV感染的敏感性，發現CHIKV侵染、繁殖能力以及誘導肌肉骨骼損傷的嚴重程度與不同品系小鼠的遺傳學差異有一定關聯，以C57BL/6小鼠最易感[31-33]。轉錄組芯片分析發現CHIKV感染C57BL/6小鼠引發關節炎的關節組織差異基因表達譜或相關免疫分子活化特征與膠原蛋白刺激小鼠引發的類風濕性關節炎以及人的類風濕性關節炎滑膜組織相應分子變化水平基本一致[34]。CHIKV誘導小鼠關節組織NK細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞等炎癥細胞活化、浸潤[30,35]。Goupil等以CHIKV感染8周齡野生C57BL/6小鼠，發現CHIKV可刺激小鼠骨骼與關節相關組織破骨細胞活化，這對揭示CHIKV患者感染早期出現骨小梁和皮質骨丟失的機制具有重要意義[6,28,36]。

臨床觀察發現，65歲以上的老年人對CHIKV高度易感，感染后疾病表癥更為嚴重，所有CHIKV相關死亡病例中老齡患者占比90%以上[37]。Uhrlaub等將CHIKV分別接種至12周齡與18月齡成年野生C57BL/6小鼠足墊皮下，發現18月齡組老年鼠關節腫脹癥狀表現更嚴重、持久，組織中病毒載量更高，病毒血癥持續時間更長。CHIKV感染誘發過度炎癥因子釋放，可能直接導致老齡組小鼠適應性免疫系統功能損傷，機體分泌中和抗體與清除病毒能力顯著降低[38]。有研究發現CHIKV感染C57BL/6小鼠，其血液、肝臟及脾臟等均可作為靶器官被CHIKV侵染，這些臟器中的病毒粒子4周內即可被機體清除，但小鼠關節相關組織病毒RNA或感染性活病毒可至少持續檢出16周[39-40]。這些長期低水平存在的CHIKV可誘導炎性細胞浸潤、炎癥相關因子持續表達，從而引發慢性滑膜炎和關節炎。另外，CHIKV的長期感染可能誘導病毒適應性變異，基因組關鍵位點的多重突變對削弱病毒抗體中和活性、增強病毒體內存活力具有重要作用[40-41]。野生型成年實驗小鼠先天免疫與適應性免疫系統發育完善，因此在抗病毒藥物與疫苗開發研究方面應用更為廣泛。Kuo等以C57BL/6實驗小鼠模型證實廣譜抗錐蟲藥物蘇拉明可明顯降低CHIKV感染后的病毒載量，下調軟骨細胞數量，顯著改善小鼠急性骨關節炎癥狀[42]。C57BL/6小鼠在CHIKV減毒苗(通過衣殼蛋白核定位序列與非結構蛋白特定功能氨基酸突變、衣殼蛋白缺失、同義密碼子替換等技術使病毒致弱)與CHIKV病毒樣顆粒疫苗，BALB/c小鼠在CHIKV滅活苗、重組黑猩猩腺病毒載體疫苗(ChAdOx1與ChAdOx2)、E2蛋白重組亞單位疫苗以及DNA疫苗(pCHIKV-7)等疫苗研發過程中用于評估不同候選疫苗的免疫原性與保護效力[43]。

3 轉基因小鼠模型

I型干擾素及干擾素刺激信號傳導途徑在機體抵抗CHIKF相關嚴重并發癥中扮演重要作用，敲除小鼠I型干擾素關鍵受體(IFNAR)、其他關鍵成分(如IRF3/IRF7)或干擾素誘導基因(如ISG-15)可顯著提高小鼠易感性[1,44]。Couderc等以野生C57BL/6(WT)、IFN-α/β R+/-與IFN-α/β R-/-基因敲除小鼠分別感染CHIKV，發現WT小鼠可以完全抵抗病毒侵染，而IFN-α/β R+/-與IFN-α/β R-/-小鼠分別誘導輕度與重癥感染。IFN-α/β R-/-試驗組小鼠出現嗜睡、肌無力、病毒血癥及神經癥狀，小鼠3 d內全部死亡，小鼠肝臟、脾臟、肌肉、關節、皮膚以及中樞神經系統可檢出高滴度的CHIKV。組織病理觀察發現CHIKV主要靶向肌肉、皮膚和關節中的成纖維細胞，對腦脈絡叢與軟腦膜細胞等組織嗜性也較高，組織中病毒載量高低與疾病嚴重程度密切相關[20]。Cook等進一步解析了不同I型干擾素亞群拮抗CHIKV感染過程的差異與機制，其中IFN-α主要作用在于阻礙CHIKV的復制和傳播，而IFN-β則通過拮抗中性粒細胞介導的炎癥反應緩解CHIKV的致病效應[45]。A129(I型干擾素受體缺陷)、AG129(I型與II型干擾素受體缺陷)以及STAT(干擾素信號轉導激活因子缺陷)轉基因小鼠模型均對CHIKV易感，試驗結果與Couderc等報道的類似[46]。Tun等應用A129小鼠模型比較分析了不同譜系CHIKV毒株的致病差異，結果顯示ECSA譜系毒株毒力更強，小鼠腦內與不同臟器中病毒復制水平最高[47-48]。I型干擾素調控子IRF3與IRF7雙基因敲除小鼠(IRF3/7-/-)感染CHIKV，會出現出血、血管炎癥和血小板減少等典型失血性休克癥狀，該模型對CHIKV導致出血熱相關休克綜合征機理研究具有重要意義[49]。Werneke等發現干擾素早期誘導因子ISG15對新生幼鼠抵抗CHIKV致死性感染發揮重要作用，ISG15基因敲除小鼠對CHIKV易感性顯著增強，炎癥因子劇烈釋放，而且ISG15的抗感染作用不依賴于泛素樣結構域UbE1L[15,37]。Delang等采用AG129轉基因小鼠模型發現抗流感藥物法匹拉韋(T-705)可以抑制CHIKV復制酶活性，降低小鼠體內病毒載量，減輕小鼠致死性病毒性腦炎癥狀，提高小鼠存活率[50]。另外，I型干擾素免疫缺陷小鼠模型在研究抗CHIKV單克隆抗體中和效應，評估昆蟲特異性甲病毒嵌合CHIKV結構蛋白疫苗(EILV/CHIKV)、VSV病毒載體重組CHIKV囊膜糖蛋白疫苗(VSVΔG-CHIKV)和高效單克隆抗體編碼序列對應mRNA疫苗(CHKV-24)的免疫原性與保護效力等方面均有應用[43,51]。

為分析宿主先天免疫與適應性免疫應答在CHIKV感染中的作用，有學者陸續構建了包括RNA病毒識別受體TLR3、T和B淋巴細胞重組酶激活基因1(RAG1與RAG2)以及B淋巴與T淋巴細胞本身在內的多種基因修飾小鼠模型用于探究機體抗CHIKV感染的機制。Her等發現TLR3介導調控CHIKV中和抗體分泌，Tlr3-/-小鼠對CHIKV更為敏感，缺陷小鼠體內病毒載量更高，炎性細胞浸潤更加嚴重[52]。CHIKV分別感染野生型、CD4-/-、CD8-/-和B淋巴細胞(μMT)轉基因小鼠，發現μMT小鼠易感性最強，CHIKV感染引發的病毒血癥持續存在，CD4-/-和μMT小鼠臨床表征最為嚴重，暗示CD4+，而非CD8+T淋巴細胞主導抗CHIKV保護性抗體作用的持續時間，并影響關節腫脹與關節炎等疾病的發生發展過程[29,53]。T淋巴或B淋巴細胞轉基因小鼠(靶向RAG1或RAG2基因)對CHIKV易感，較野生型小鼠感染CHIKV的疾病表型與病毒血癥更為嚴重，機體適應性免疫可通過調節炎癥反應以抵抗CHIKV的感染[29,39,54]。CHIKV刺激APCs細胞分泌IFNγ，活化TH1型CD4+T細胞極化，募集炎性單核細胞至感染區域。Carissimo等發現ISG蛋白家族的Viperin因子抗CHIKV感染與其調控CD4+T細胞的極化作用有關，Viperin-/-缺失小鼠感染CHIKV誘發關節炎病理表現更為嚴重[55]。CHIKV感染會刺激機體γδT亞群淋巴細胞的高水平增殖，γδT細胞缺失的轉基因小鼠感染CHIKV后體重增長減緩，關節腫脹與炎癥反應特征明顯增強[56]。上述試驗說明特定免疫應答相關靶基因缺陷轉基因小鼠對CHIKV易感性的改變，對深入挖掘、驗證重要的宿主抗病毒效應因子、評估藥物或疫苗的免疫保護效力等方面具有重要意義，但相應小鼠感染CHIKV出現的發病急、死亡快、病理周期短等現象，限制了轉基因小鼠模型在CHIKV引發持續關節炎型感染表型機制研究的應用。

4 小 結

目前，基孔肯雅病毒已擴散至全球五大洲，累計引起數百萬人感染。CHIKF的蔓延與傳播加快了科學家們對CHIKV的研究步伐，尤其是在CHIKV誘發急性和慢性關節炎相關疾病的感染機制、疫苗與靶標藥物開發等方面取得了較大進展[43,57]。合適的動物感染模型對于開展CHIKV基礎與應用研究必不可少。

小鼠感染模型是CHIKV研究最深、應用范圍最廣的動物模型，近年來，基孔肯雅病毒小鼠模型對加快CHIKV的基礎與應用性研究起到了關鍵性作用。不同類別或品系的小鼠感染CHIKV臨床表型各有特征，適用范圍略有差異，C57BL/6實驗小鼠對CHIKV較為易感，遺傳特性相對穩定，在病毒感染與免疫保護等應用最為廣泛。新生幼鼠與轉基因小鼠適用于研究CHIKV感染引發人腦炎等致死性病變的致病機制，探究CHIKV感染相關宿主關鍵互作因子、介導宿主抗病毒免疫相關組分的鑒定與驗證、評估特定中和抗體或藥物的抗病毒效果以及重組載體活疫苗與mRNA疫苗免疫保護作用，而野生型成年實驗小鼠主要用于模擬CHIKV引發急性肌肉損傷與骨關節疾病、慢性持續性關節炎相關疾病以及評估不同類型的疫苗或藥物保護效果。

盡管小鼠模型在CHIKV應用最多，優勢明顯，但其仍然存在缺陷。不同品種與年齡組的小鼠CHIKV感染結局差異較大，小鼠模型不能準確模擬CHIKV母嬰垂直傳播方式。另外，小鼠與人類的遺傳進化關系較遠，與人體肌理結構及微環境存在較大差異，病毒黏附鼠源細胞與胞內復制能力明顯低于人源細胞[15,58]。小鼠壽命有限，CHIKV感染的小鼠組織易被損傷破壞[10]，也不能完整模擬人感染CHIKV引發慢性持續性疾病的終生過程。迄今為止，國內外尚無理想的動物模型能夠完全模擬人感染CHIKV表現出的所有急、慢性臨床表型，繼續探索不同動物模型間的感染差異機制，開發、優化新的動物感染模型，仍是CHIKV研究取得突破進展的重點和難點之一。