鈦種植體表面銀納米顆粒負載方法的進展

朱俊瑾 王劍

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院修復科 成都610041

種植義齒是牙列缺損、牙列缺失的常見修復方法，其中鈦種植體因其高強度、耐用性和良好的生物相容性而廣泛應用于種植修復中[1]。但是鈦種植體本身不具備抗菌性能，若發生細菌感染并進展至種植體周圍炎，則會引起種植體周骨質喪失，組織愈合不良，最終可能導致整個種植治療失敗。因此，需要在鈦種植體上構建抗感染表面以增強其抗菌能力，降低種植體失敗的可能性。

與牙周炎相似，種植體周圍炎中能檢出較多的革蘭陰性厭氧菌，此外還可檢出其他幾種微生物，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌[2]。已有研究嘗試在鈦表面加載抗生素如萬古霉素[3]、慶大霉素[4]等，以降低種植體植入后的感染風險，然而，傳統的抗生素會因為細菌耐藥性而失效，且針對的微生物數量有限，無法對抗多種感染[5-6]，仍會導致種植失敗。因此，金屬納米粒子作為抗菌劑的研究受到了廣泛的關注。其中，銀納米顆粒（silver nanoparticle，Ag NP）有其經久不衰的生命力，至今約有130年的歷史[7]。它的抗菌譜廣、耐藥性很低，可以殺死多種細菌并在生理條件下保持穩定[8-9]。它可通過與微生物表面直接接觸或局部釋放Ag+，從而高效殺死細菌[10]。然而研究表明，它對哺乳動物可能具有細胞毒性[11-12]，釋放的Ag+會由于對硫、氮的親和力而干擾細胞活動過程[13]。為此，近10年來研究人員關于鈦基表面負載Ag NP方面進行了大量的研究，通過調整摻銀方法或添加其他物質，在保證鈦種植體高效抗菌性能的同時避免Ag NP的細胞毒性。

本文綜述了目前在鈦種植體表面負載Ag NP的主要制備方法及其優缺點，并針對如何優化Ag NP的負載量和降低細胞毒性方面進行了方法總結，為鈦種植體負載Ag NP的抗菌研究提供參考。

1 物理方法負載Ag NP

常見的物理方法有等離子體浸沒離子注入（plasma immersion ion implantation，PIII）和濺射法。其工藝流程簡單、快速，得到的Ag NP純度較高，但是對設備要求較高、生產成本高。此外，由于Ag NP與基材間具有較強的結合力，不易釋放Ag+，故物理方法負載的Ag NP主要以接觸殺菌機制實現抗菌作用。

1.1 PIII技術

PIII技術目前已廣泛應用于各種生物醫學材料或設備的表面改性[14]。等離子體源經負高壓脈沖在材料基體周圍形成一個等離子體鞘層，加速的正離子從各個方向垂直轟擊材料基體并注入基體表面，形成一層富集注入元素的改性層[15]。銀等離子體浸沒離子注入（silver plasma immersion ion implantation，Ag-PIII）可在鈦表層形成Ag NP改性層，由于改性層與材料基體間沒有明確界限，故Ag NP與鈦基體結合緊密[8]，使Ag NP活動受限，避免了Ag+累積釋放引起的細胞毒性[16]。該技術還能精確調控注入量與區域，通過調整Ag-PIII參數改變Ag NP的直徑，可直接影響Ag NP的殺菌效果。Zhu等[17]發現，粒徑呈2 nm和11~12 nm雙峰分布的Ag NP，對金黃色葡萄球菌和具核梭桿菌的殺菌效果要明顯大于粒徑為4~6 nm的Ag NP。然而，通過Ag-PIII負載的Ag NP大多是通過接觸殺菌機制，主要對黏附細菌表現出優異的抗生物膜活性，由于Ag+釋放少，故對游離細菌的殺菌作用較弱[18]。此外，Ag-PIII工藝帶來的牢固結合力，在消除Ag NP毒副作用的同時，還能促進骨形成。特定粒徑范圍（4~25 nm）的Ag NP可激活大鼠骨髓干細胞中整合素α5調控的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細 胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein ki‐nase，ERK）信號級聯，從而促進成骨細胞分化并促進鈦的骨整合[18-19]。同時，Ag NP和鈦基質間的微電流效應[8]或由電子轉移產生的細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）[20]，既賦予鈦板較強的抗菌活性，又能促進成骨細胞黏附、生長和增殖。但這也會使得鈦樣品表面測得的腐蝕電流增加，樣品的耐腐蝕能力會略有下降[8,20]。

1.2 濺射法

濺射法作為原子逐層沉積工藝，是在真空室內以電流電離惰性氣體，高速氣體離子轟擊靶材得到濺射粒子，濺射粒子到達基材，并經過吸附、凝結、表面擴散遷移、碰撞結合形成穩定晶核，具有較低的工藝溫度，較高的沉積速率和相對較高的膜與膜之間的結合強度等特點[21]。使用直流等離子體濺射，數分鐘內可在鈦表面形成Ag NP，且隨著濺射時間增加，鈦基材上沉積的銀含量增加。Kheur等[22]使用直流濺射技術，在氮氣環境下，5 min內即可在鈦盤上沉積6 μg·mm-2的Ag NP，在6 h內實現對黏附的變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的強抗菌活性。然而，濺射法產生的抗菌活性主要針對黏附細菌，對游離細菌的抗菌活性并不明確[23-24]，這可能與強結合力導致銀釋放受限有關。針對物理方法引起的Ag+釋放量低等現象，Abuayyash等[25]通過在鈦表面相繼濺射鉑和銀，形成以銀為犧牲陽極的體系，通過電化學驅動原理促進銀的溶解和釋放，從而實現對游離細菌更高的抗菌活性，然而該溶解過程會對人間充質干細胞（human mesenchymal stem cell，hM‐SC）的細胞活力產生負面影響，但作者指出，Ag NP的快速溶解受載銀量影響而具有自限性，在它溶解后，組織細胞的黏附可再次發生。

2 化學方法制備含Ag NP涂層

迄今為止，使用化學方法在鈦基材上負載Ag NP仍是最廣泛、最經濟的方法，它對設備的要求不高，一般是將鈦基材浸入含有銀鹽的溶液中，然后用還原劑、紫外光等將Ag+轉化為Ag NP，或者采用電化學沉積、自組裝技術負載Ag NP。這些方法制備的Ag NP通常與基材間的結合力較弱，因此更容易釋放且易氧化生成Ag+，進入細菌體內引起大分子物質（蛋白質、酶和核苷酸）的失活，從而導致細菌死亡[26]，但是其較高的突釋量可能帶來細胞毒性問題。

2.1 化學還原法

化學還原法是在鈦表面制備Ag NP的簡單而經濟的方法，在水或有機溶劑中，銀鹽前驅體、還原劑、溶劑、穩定劑在適當條件下反應，在鈦表面還原出銀單質。硝酸銀是使用最廣泛的銀鹽前體，而檸檬酸鈉、乙二醇、抗壞血酸、硼氫化鈉（NaBH4）、Tollens試劑、N, N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）等則是最常見的還原劑[27]。使用Tollens試劑改性鈦圓片，0.05 mg·L-1的Ag+即可對變異鏈球菌、唾液鏈球菌、口腔鏈球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等多種細菌表現出較強的抗菌能力，足以抑制革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，然而浸泡在Tollens試劑中的時間越長，負載的銀含量越多，早期突釋現象也越明顯，當Ag+釋放的質量濃度達到0.1 mg·L-1，會使人成骨細胞的活力顯著下降[28]。由于化學還原法制備的Ag NP產量低，使用的試劑如NaBH4、DMF等為有毒化學物質，會對環境和生物體構成威脅，近10年來已少有使用。有學者嘗試其他更為安全的還原劑，例如Gunputh等[29]提出用δ-葡萄糖酸內酯作為還原劑，通過順序添加法可在TiO2表面將AgNO3還原為Ag NP，細菌實驗表明其載銀鈦樣品具有強抗菌性能，然而其生物細胞安全性仍需進一步的研究。

2.2 光還原法

光還原法一般是用紫外光對浸沒在AgNO3溶液中的鈦基材照射30~60 min，從而將鈦表面Ag+轉化為Ag NP[9,30-34]，可在鈦表面均勻分布[31,34-35]。該方法避免了化學試劑的不良反應而逐漸受到人們的推崇。然而這樣負載的Ag NP量較少，且與鈦表面的結合力弱，容易出現早期突釋現象，無法賦予鈦種植體長期的抗菌性能。基于此，學者們[36-37]對鈦基材表面進行陽極氧化，通過形成均勻有序的TiO2納米管（TiO2nanotube，TNT）陣列，將Ag NP容納于內部來增加Ag NP的負載量，殺菌效果可長達30 d。此外，學者們也嘗試在鈦基材上增加負電荷來負載更多的Ag+。一些學者[9,33]根據氧化石墨烯（graphene oxide，GO）帶負電荷的性質，在鈦板上電鍍GO，通過增加GO濃度可增加負載的Ag+含量，然后經紫外光還原形成Ag NP，從而使鈦樣本表現出較強的抗生物膜黏附性能和抗菌性能。然而細胞實驗[33]表明，載GO-Ag的鈦板會影響大鼠骨髓間充質干細胞的細胞活力。

2.3 電化學沉積法

電化學沉積是指在電場作用下，通過電解質溶液的化學反應，使溶液中的離子沉積到陰極或陽極表面上形成薄膜或涂層的過程，需要控制溶液pH值、溫度、濃度、電流等條件來控制沉積層的厚度、組成及結構等。其操作簡單、成本低廉、環境安全，但是制備理想的、復雜組成的薄膜材料較為困難，應用不當的參數會使材料表面載銀異常。在高電壓、高電流、長時間及高濃度Ag+條件下，制備出的載銀試樣表面會附著大小不均的銀顆粒，且附著強度低，甚至無法耐受超聲清洗[38]。然而有研究[39]表明，在銀層表面進一步涂覆羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）可減少銀的脫落率，提高鈦樣品的抗菌性能。使用陽極氧化和電沉積法在鈦種植體上制備含銀的超疏水性表面可降低Ag+的早期突釋，同時抑制細菌黏附[40]。

2.4 自組裝技術

自組裝技術是一種以基本結構單元自發形成有序結構的綠色、經濟的技術。使用逐層（layerby-layer，LBL）自組裝可在基板上涂覆功能性薄膜，該方法通過沉積帶相反電荷的聚電解質的交替層[41]，可在鈦表面構造含Ag NP的連續抗菌涂層[42-43]，具有簡單、成本低等優點，但涂層穩定性仍需改善。Zhong等[42]以相轉移溶菌酶作為鈦表面底漆，然后通過自組裝技術以殼聚糖/透明質酸負載Ag NP，形成的抗菌涂層可在4 d內完全殺死非附著細菌和附著細菌，14 d后的抗菌效果也可達65%~90%。但是隨著含銀量增加，溶液中累積的銀濃度升高，樣品的細胞毒性越明顯。然而，當Zhang等[44]以LBL技術將多巴改性的藻酸鹽/殼聚糖涂覆在鈦合金表面，然后將Ag NP原位沉積在多層結構中，由于多巴改性后的涂層具有兒茶酚等較多的有機官能團，更具生物相容性，因此在實現抗細菌黏附作用的同時，能夠提高細胞活力。

3 生物方法制備Ag NP涂層

生物方法主要使用生物分子的黏附性能負載Ag NP，其反應條件溫和，具有生產成本低、綠色環保等優點，但投入時間較長，通常需要花費數天時間。

海洋生物貽貝可以牢固地黏附在大多數基質上，強大黏附力的關鍵因素是貽貝蛋白質結構中多巴和賴氨酸富集蛋白，其中，含兒茶酚的多巴及其衍生物不僅可以牢固附著在材料上，形成穩定的表面涂層，并且還可以充當還原劑還原金屬離子[45-47]。聚多巴胺（polydopamine，PDA）可將Ag NP裝載到鈦板上或TiO2納米管上以殺死細菌[47-48]，90 °C水浴條件可明顯縮短形成PDA涂層的反應時間[47]。Cheng等[49]通過合成水溶性的含兒茶酚胺的殼聚糖（chitosan，CS），在鈦板表面形成涂層，然后浸泡于17 mg·mL-1AgNO3溶液中，將表面Ag+原位還原，抑菌數量達3個數量級（金黃色葡萄球菌量從107到104，大腸桿菌量從106到103），且未發現明顯的細胞毒性。此外，多巴胺及其衍生物還能夠在材料表面黏固一些生物活性物質（如HA、CS和金屬基質）形成雜化涂層，賦予鈦種植體更好的抗菌活性、生物相容性和促成骨活性[30,47,50]。例如，CS上帶有豐富的氨基和羥基，可作為金屬離子的結合位點[51]，充當Ag NP和Ag+的理想螯合劑[52]，發揮穩定釋放Ag+的作用。

4 多種技術復合運用以優化Ag NP 的負載量和降低細胞毒性

目前，在鈦種植體表面負載Ag NP的方法眾多，但主要是圍繞Ag+早期突釋、釋放時間較短引起的遠期殺菌能力弱和潛在的細胞毒性問題展開，負載的Ag NP應在有效殺滅病原體和組織生物相容性之間達到平衡。故在前述負載方法的基礎上，學者們復合多種技術來優化Ag NP的負載情況，主要從優化負載量和降低細胞毒性兩方面進行改良。

4.1 優化鈦種植體上Ag NP的負載量

使用化學方法負載Ag NP通常會存在Ag NP負載量不足或負載不穩定等問題，故多數學者對鈦種植體表面進行結構設計，例如使用陽極氧化、等離子體電解氧化（plasma electrolytic oxidation，PEO）等，在鈦基材上形成具有微/納米孔隙的鈦氧化物層，充當Ag NP的儲層，并通過前述的負載方法，從而增加Ag NP的負載量和負載穩定性。若結合選擇性激光熔化（selective laser melting，SLM）技術，在Ti-6Al-4V種植體上設計合理的多孔結構，可明顯增加Ag NP附著的表面積，Ag+釋放時長可持續至少28 d，獲得更強的殺菌效果和抗生物膜形成能力[53-54]。類似的，優化負載Ag NP的涂層表面積和形態也可提高載銀效率，Tian等[55]通過在Ti-6Al-4V鈦合金基底上制備具有定向塊陣列的HA涂層，改變了表面電荷和比表面積，提高了載銀效率，并具有較強的殺菌和抗生物膜形成作用，還能促進成骨細胞生長黏附、分化和礦化。此外，在鈦表面形成具有較強黏附力的涂層以增加Ag+的附著也是常用的方法， PDA涂層常用以黏附Ag+，它以兒茶酚作為溶液中Ag+的螯合劑，在鈦樣品充分浸泡于銀鹽溶液中后，結合紫外光還原法，可在表面沉積更高密度的Ag NP[32,47]。另外，通過提高Ag+的還原效率也可增加鈦種植體上Ag NP的負載量。

4.2 降低Ag+的細胞毒性

首先，設計合理濃度的含Ag+溶液進行Ag NP負載是必要的，在此基礎上，可選擇具有強黏附力的物質（如PDA）作為載銀涂層，或在含銀涂層上繼續加載生物活性物質（如CS[30,34]、HA[56]），或者二者兼施以減緩銀的釋放。Xie等[50]在載銀前后分別涂覆PDA和CS，該雙重螯合作用顯著降低了雜化涂層中銀的釋放。Yuan等[36]在基于殼聚糖的氨基與海藻酸鹽的醛基之間的共價結合和LBL的靜電相互作用，將殼聚糖和海藻酸鹽加載到載有Ag NP的TNT陣列上，完全覆蓋TNT-Ag的納米孔結構，有效防止初始階段的Ag+突釋，能顯著降低細胞毒性，同時抑制細菌黏附。

此外，添加某些金屬元素或可降低Ag NP的細胞毒性。有研究[21]報道，在載銀鈦板上加入鍶（Sr）元素，可減輕Ag潛在的細胞毒性，同時保持其最佳抗菌性能。這與Sr競爭性地占據了細胞上特定的結合位點有關。同時引入Sr和Ag還可顯著改善改性層的耐蝕性。此外，在鈦植體上同時載入鋅（Zn）和Ag，可降低Ag+的釋放速率，這是由于Zn的摻入會減少Ag的負載，并且鈦種植體表面Zn與Ag的微電流耦合作用可抑制Ag NP氧化及隨后Ag+的釋放，然而這并不影響鈦樣品的抗菌性能，結果[54]顯示種植體周圍仍能形成抑菌區。

5 小結

在鈦種植體上加載Ag NP對于預防種植體周圍炎的發生及進展十分重要，目前已有多種技術用于負載Ag NP，包括物理方法、化學方法和生物方法，盡管各方法仍存在些許不足，但研究人員通過調控鈦基或鈦基上載銀涂層的結構形態，加入其他成分如生物活性物質或金屬元素等，結合多種技術，可調節鈦基表面Ag NP的負載量及涂層的穩定性，控制Ag+的釋放，提高了抗菌效果且減少或避免了細胞毒性。目前，關于探究載Ag NP鈦種植體對體內環境影響的研究逐漸增多，人們可以更加充分地認識到Ag NP的抗菌效果和細胞毒性風險，隨著現代經濟技術的快速發展，在鈦種植體上實現低成本、高效率地負載含Ag NP涂層的趨勢也有助于加快這一研究進程。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。