富硒當歸淫羊藿方對大鼠睪丸SOD、MDA及血清性激素的影響

李金濤 李時軍 宋章興 向 奎 趙 華 崔應東 田朝暉

1.湖北民族大學醫學部，湖北恩施 445000；2.湖北省恩施土家苗族自治州民族醫院泌尿外科、男科，湖北恩施 445000；3.湖北省恩施土家苗族自治州民族醫院醫務部，湖北恩施 445000

男性不育是一個嚴重的全球性醫學和社會問題，據研究表明大約有15%的夫婦受到不育癥的影響，其中40%～50%的病例歸因于男性不育癥[1]。約有45%的男性不育原因不明，影響因素包括精索靜脈曲張、睪丸衰竭、內分泌功能障礙、生殖道感染、肥胖、高齡、遺傳因素等[2]。腺嘌呤是一類腫瘤化療藥物，但由于其可抑制生精細胞的產生從而被應用于建立動物不育模型[3]。本研究應用不同劑量的富硒當歸淫羊藿方對腺嘌呤造模后的大鼠進行干預，觀察藥物對模型大鼠睪丸超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及血清卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、睪酮（testosterone，T）的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取6 周齡雄性SPF 級SD 大鼠58 只，體重150～180 g，由三峽實驗動物中心提供（合格證號：SCXK 鄂2017-0012）。按照中華動物倫理學要求飼養和處理動物，造模前適應性飼養1 周，普通飼料，定時喂食，自由飲水，12 h 光照/d，室溫保持在20～26℃，飼養于恩施州中心醫院湖北硒與人體健康研究院。

1.2 藥物與試劑

富硒當歸淫羊藿方中當歸30 g（恩施富硒藥材）、淫羊藿20 g（恩施富硒藥材）、黃芪15 g（恩施富硒藥材）、丹參30 g、菟絲子20 g、小茴香15 g，由恩施州民族醫院藥劑科提供，常規方法煎煮，濃縮至生藥量1.66 g/mL，經測得藥物含硒量為50 μg/mL，4℃冰箱保存。腺嘌呤（批號：S09S10D97125），購自上海源葉生物科技有限公司；SOD 試劑盒（批號：20191210）、MDA 試劑盒（批號：20191209）購自南京建成生物工程研究所；LH 檢測試劑盒（批號：SE0RD094566）、FSH檢測試劑盒（批號：SE0RD095822）、T 檢測試劑盒（批號：SE0RD098100）均購自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.3 儀器

NanoDrop2000 超微量分光光度計（Thermo 公司）；D3024R 臺式高速冷凍型微量離心機（DragonLab 公司）；AD18 高速分散勻漿機（上海昂尼有限公司）；KD-2258石蠟切片機、KD-P 攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；Pannoramic SCAN 數字全掃儀器（3DHISTECH 公司）。

1.4 方法

1.4.1 建立模型 隨機選取10 只雄性SD 大鼠作為正常組，余下大鼠參照隨機數字表法分為四組：模型對照組，富硒當歸淫藿方高、中、低劑量組，各12 只。正常組大鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液，灌胃量為10 mL/（kg·d），模型對照組和富硒當歸淫羊藿方高、中、低劑量組灌胃500 mg/（kg·d）腺嘌呤混懸液，灌胃量為10 mL/（kg·d）。灌胃共15 d，造模結束。

1.4.2 實驗藥物干預 富硒當歸淫羊藿方高、中、低劑量組大鼠依據《實驗動物學》[4]確定給藥劑量，高劑量組每只大鼠灌服富硒當歸淫羊藿方20.92 g/（kg·d），中劑量組每只大鼠灌服富硒當歸淫羊藿方10.46 g/（kg·d），低劑量組每只大鼠灌服富硒當歸淫羊藿方5.23 g/（kg·d），連續灌胃30 d。

1.4.3 取材 實驗第46 天，稱重各組大鼠，用4%水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血8～10 mL 于玻璃試管中，靜止3 h，離心4 min（4000 r/min，13.5 cm），吸取血清放置于-80℃低溫冰箱保存；分離睪丸組織，右側睪丸置于福爾馬林液中固定，用于制備睪丸病理切片，左側睪丸制備成組織勻漿，用于測定SOD 和MDA 的含量。

1.4.4 檢測項目 觀察各組大鼠體重、飲食、尿量等一般狀況；WST-1 法檢測睪丸組織勻漿SOD；酶聯免疫吸附法檢測MDA 含量；酶聯免疫吸附法檢測血清性激素FSH、LH、T 含量；比較各組大鼠睪丸病理切片結果。

1.5 統計學方法

采用SPSS 26.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀態觀察

實驗開始前各組一般狀態良好，飲食、尿量均正常，毛色光鮮亮麗。造模第4 天開始，模型對照組和富硒當歸淫羊藿方各劑量組逐漸出現飲食量減少，尿量逐漸增加（需每日更換墊料），飲水量多，體重下降，弓背，毛發失去光澤，甚至逐漸出現死亡。造模結束后，模型對照組，富硒當歸淫羊藿方高、中、低劑量組各死亡1 只。死亡大鼠經解剖后，肺部未發現藥液殘留及出血點，排除灌胃致死的原因，腎臟出現腫大與出血點，提示因為腎衰竭等原因致死。開始進行實驗藥物干預后，富硒當歸淫羊藿方各劑量組逐漸出現飲食量增加，體重增加，尿量逐漸恢復如常，毛發也逐漸恢復光澤。灌胃腺嘌呤大鼠出現豎毛、瞇眼、弓背等臨床表現，見圖1。

圖1 灌胃腺嘌呤大鼠的臨床表現

2.2 富硒當歸淫羊藿方對大鼠睪丸組織勻漿SOD、MDA 的影響

與正常組比較，模型對照組睪丸組織勻漿SOD 下降，MDA 上升，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01）；與模型對照組比較，富硒當歸淫羊藿方高、中劑量組SOD 均不同程度升高，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01），但富硒當歸淫羊藿方低劑量組與模型對照組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；與模型對照組比較，富硒當歸淫羊藿方高、中、低劑量組MDA 均不同程度降低，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01）。見表1。

表1 富硒當歸淫羊藿方對大鼠睪丸組織勻漿SOD、MDA 的影響（）

表1 富硒當歸淫羊藿方對大鼠睪丸組織勻漿SOD、MDA 的影響（）

注：與正常組比較，##P ＜0.01；與模型對照組比較，**P ＜0.01。SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

2.3 富硒當歸淫羊藿方對大鼠血清FSH、LH、T 的影響

2.3.1 血清FSH 與正常組比較，模型對照組血清FSH上升，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；富硒當歸淫羊藿方低劑量組血清FSH 與模型對照組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；與模型對照組比較，富硒當歸淫羊藿方高、中劑量組血清FSH 下降，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01）。見表2。

2.3.2 血清LH 與正常組比較，模型對照組血清LH上升，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；富硒當歸淫羊藿方低劑量組血清LH 與模型對照組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；與模型對照組比較，富硒當歸淫羊藿方高、中劑量組血清LH 下降，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01）。見表2。

2.3.3 血清T 與正常組比較，模型對照組血清T 下降，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；富硒當歸淫羊藿方低劑量組血清T 與模型對照組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；與模型對照組比較，富硒當歸淫羊藿方高、中劑量組血清T 升高，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01）。見表2。

2.4 睪丸組織病理學結果

正常組睪丸結構正常，生精小管邊界完整，管腔飽滿，腔內可見成熟精子，生精細胞層次分明，間質細胞排列整齊；模型對照組睪丸生精小管病變嚴重，出現基膜塌陷，層次減少，排列不齊，生精小管間質疏松水腫，可見生精細胞變性壞死，成熟精子減少，殘存的支持細胞管腔呈空洞樣；富硒當歸淫羊藿方低劑量組與模型對照組比較，形態稍有好轉，生精小管結構可見；富硒當歸淫羊藿方中劑量組曲細精管形態有所恢復，管壁分層可見，少量的生精細胞可見。在生精小管管腔內有積液充滿管腔，與模型對照組比較有了明顯好轉；富硒當歸淫羊藿方高劑量組可見曲細精管形狀規整，生精小管管壁結構良好，生精細胞明顯增多，可見精子細胞，生精小管間質有輕微的疏松水腫和輕微的纖維增生。總體改善程度較富硒當歸淫羊藿方低、中劑量組效果好。見圖2。

表2 富硒當歸淫羊藿方對大鼠血清FSH、LH、T 的影響（）

表2 富硒當歸淫羊藿方對大鼠血清FSH、LH、T 的影響（）

注：與正常組比較，##P ＜0.01；與模型對照組比較，**P ＜0.01。FSH：卵泡刺激素；LH：黃體生成素；T：睪酮

圖2 富硒當歸淫羊藿方對大鼠睪丸組織病理組織結構的影響（HE，200×）

3 討論

腺嘌呤是氮雜環嘌呤類化合物，臨床上被應用于預防各種原因導致的白細胞減少癥[5]。但由于腺嘌呤可導致慢性的肝腎功能不全，影響大鼠睪丸功能，因此也被用于構建男性不育動物模型[6]。其作用機制包括以下5 個方面。首先，大量攝入腺嘌呤后，腺嘌呤代謝產物尿酸會因過飽和形成尿酸結晶沉積于腎小管，造成腎小管堵塞和炎癥反應；其次，攝入大量的腺嘌呤使黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性增加，從而產生大量氧自由基，減少精子和性激素的生成；同時腺嘌呤也會影響17β 羥基類固醇脫氫酶（17βhydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD）活性，導致T合成減少。最后，腺嘌呤也可導致腎素血管緊張素系統被破壞，影響性腺的血液循環[7-10]；最新研究還表明，腺嘌呤也可引起間質細胞轉化生長因子-β（Transformed growth factor-β，TGF-β）的表達增加和對稱性二甲基精氨酸（SMDA）蛋白的表達異常，使精子的產生受到抑制[11]。灌胃腺嘌呤后，大鼠會出現飲食下降、尿多、飲水量多、體型消瘦、弓背及毛發失去光澤等特點，本研究在大鼠造模期間逐漸出現上述癥狀，一定程度提示造模的成功，符合不育動物模型的臨床表現。

氧化應激是導致精液質量下降的原因之一，其中氧化應激是由于產生過多活性氧和自由基引起。精子由于缺少細胞質的保護容易受到活性氧的有害影響[12-13]。活性氧攻擊精子的過程中會產生MDA，因此MDA 的含量被廣泛用于反映精子所遭受的過氧化損傷的水平[14]。Kefer 等[15]認為機體除了存在大量的氧化劑，也存在許多抗氧化劑。SOD 是一類重要的氧化劑清除劑，可催化超氧化物轉化為氧氣和過氧化氫；Walczak Jedrzejowska 等[16]認為微量元素硒也是一種非酶類抗氧化劑，可防止精子DNA 的氧化損傷。實驗表明，缺硒可導致生精上皮的萎縮、精子生成和成熟的障礙[17]。性激素對精子的生成也起著重要的作用，性激素含量的異常將影響精子的生成。本研究結果顯示，與正常組比較，模型對照組SOD 活力下降、MDA 含量上升，血清性激素FSH、LH、T 水平異常，提示過量的腺嘌呤在模型對照組大鼠體內蓄積，通過氧化應激造成大鼠睪丸的損傷。

湖北恩施地區有“世界硒都”[18]的稱號，有許多富硒的中草藥。富硒當歸淫羊藿方由當歸、淫羊藿、丹參、菟絲子、黃芪、小茴香6 味中草藥組成。其中當歸、淫羊藿、黃芪均為恩施富硒藥材，經權威部門檢測當歸含硒量約為7.45 mg/kg，淫羊藿含硒量約為6.47 mg/kg，黃芪含硒含硒量約為14.47 mg/kg[19]。研究表明，當歸中黃酮類化合物具有明顯的抗氧化作用，可使血清中SOD 活力明顯增高及MDA 含量降低；淫羊藿也具有延緩性腺衰老、促進性激素分泌、增加精子數量的作用，用淫羊藿灌胃后的腎陽虛大鼠血清睪酮含量增加；菟絲子的提取物可增加精液SOD 活力、降低MDA 含量，并對氧化應激造成睪丸損傷起保護作用；黃芪是另一類抗氧化的中藥材，黃芪可降低TGF-β 的表達和SMDA 蛋白的異常表達[20-27]，陳啟云等[28]運用黃芪多糖干預沙門菌下暴露的大鼠，生精細胞的調亡和睪丸組織的破壞得到明顯的緩解；丹參也是一種具有多重作用的中藥材，除了具有抗炎、抗細胞凋亡的等作用外，丹參能降低MDA 的損傷，并提高SOD 的活性；另有研究也表明小茴香在清除超氧陰離子和抗氧化方面也具有重要的作用[29]。本研究結果顯示，灌胃富硒當歸淫羊藿方中藥合劑后，與模型對照組比較，富硒當歸淫羊藿方高、中劑量組大鼠出現了體重增加、SOD增加、MDA 水平降低、性激素水平趨于正常等變化，提示富硒當歸淫羊藿方能一定程度緩解腺嘌呤對大鼠睪丸的損害。富硒當歸淫羊藿方低劑量組情況較模型對照組雖有所好轉，但差異無統計學意義（P ＞0.05），提示低劑量的富硒中藥不能使大鼠生精功能恢復正常。富硒當歸淫羊藿方高劑量組與模型對照組比較，差異有統計學意義（P ＜0.05），提示高劑量富硒中藥可以改善腺嘌呤灌胃后對大鼠睪丸的氧化應急損傷，能使生精功能恢復正常。但本研究尚未細致探討不同硒濃度是否對腺嘌呤造模后大鼠睪丸SOD、MDA 及血清性激素產生影響，故需后續實驗予以證明。

綜述所述，富硒當歸淫羊藿方可通過提升睪丸SOD 活力、降低睪丸MDA 水平，維持性激素FSH、LH、T 的穩定，一定程度上緩解腺嘌呤對睪丸氧化應激的損傷，維持睪丸性激素平衡。