PD-L1和A2aR在大腸癌中的表達及意義

方宇 王海娟 李征洋 張黎

大腸癌包括結腸癌和直腸癌兩種病理類型，是臨床常見的惡性腫瘤之一，近年來，其臨床發病率及死亡率均呈現出不斷上升的趨勢，盡管隨著醫療技術及設施設備的提高和改進，患者生存時間有所延長，但患者術后5年生存率仍只有50%左右[1,2]。腫瘤的發病涉及多基因、多通道、多步驟等復雜過程，其發展多與機體免疫相關，通過對免疫檢查點的免疫檢測作用來實現腫瘤細胞的分化和增殖[3]。細胞程序死亡配體1(PD-L1)是免疫家族負性調節因子PD-1的配體蛋白，PD-L1與PD-1分子的結合而組成PD-1/PD-L1通路，通過提高及活化體內過氧化氫和活性氧水平來促進體內特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)凋亡，抑制免疫系統對腫瘤細胞的攻擊[4]。腺苷2a受體(A2aR)為1種免疫逃逸因子，可通過激活T、B細胞中腺苷酸環化酶生成環磷酸腺苷(cAMP)，負性調節CTL對腫瘤細胞的免疫殺傷[5]。目前，而由PD-1/PD-L1通路與腺苷介導的免疫逃逸之間是否在腫瘤發展過程中存在協作關系尚不十分明確。因此，本研究通過研究PD-L1與A2aR在大腸癌及其對應癌旁組織中的表達及與臨床病理特征的關系。從而探討兩者在大腸癌發生、發展、臨床治療及預后中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年12月至2018年7月治療的76例大腸癌患者癌組織及其對應的癌旁組織石蠟標本作為研究對象。所選標本患者術前均未接受放化療及其他輔助治療，患者術后經實驗室病理學檢查證實為大腸癌，臨床病歷資料完整，研究經院倫理會批準同意。其中，男47例，女29例；年齡32～69歲，平均年齡(62.35±4.46)歲；<60歲31例，≥60歲45例；腫瘤直徑(5.24±1.23)cm：<5 cm 52例，≥5 cm 24例；TNM分期：Ⅰ 期15例，Ⅱ期24例，Ⅲ 期26例，Ⅳ 期11例；癌分化程度Broders分級：Ⅰ 期16例，Ⅱ期39例，Ⅲ 期21例；浸潤深度：漿膜內42例， 漿膜外34例；淋巴結轉移情況：有32例，無44例；脈管侵犯情況：有47例，無29例。

1.2 檢測方法 PD-L1、A2aR均采用免疫組化染色法進行檢測，其中，兔抗人多克隆抗體 Anti-PD-L1，(貨號E07C0574)，anti-A2aR(貨號E07C0865)均購自上海自藍基生物科技有限公司，免疫組織化學相關試劑盒購自賽默飛世爾科技公司，PD-L1、A2aR檢測操作過程均嚴格按照試劑盒所提高的使用說明書進行。

1.3 免疫組化染色結果判斷 PD-L1、A2aR陽性判斷標準參照相關文獻[6,7]對免疫染色結果的評價方法，采取雙盲獨立觀察法進行評估，以細胞膜及細胞質出現黃或褐色顆粒為陽性表達。根據PD-L1、A2aR陽性細胞所占的比例及顯色強度進行評分。陽性細胞比例計分方法：陽性細胞比例0～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分；顯色強度計分方法：未出現黃色或褐色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，褐色計3分。以陽性細胞所占比例和顯色強度兩項計分之乘積為PD-L1、A2aR染色陽性結果判斷標準，其中，PD-L1兩項乘積結果3分級以上判斷為陽性表達，A2aR兩項乘積結果5分級以上判斷為陽性表達。分別計算PD-L1、A2aR的陽性表達率。

2 結果

2.1 PD-L1、A2aR蛋白在大腸癌組織及其對應癌旁組織中的表達情況 PD-L1蛋白在大腸癌組織中的陽性表達率(56.68%)明顯高于其腸癌旁組織(31.58%)，差異有統計學意義(P<0.05)；A2aR蛋白在大腸癌組織中的陽性表達率(71.05%)顯著高于其腸癌旁組織(34.21%)，差異有統計學意義(P<0.001)。見表1，圖1。

表1 PD-L1、A2aR蛋白在大癌組織及其對應癌旁組織中的表達結果比較 n=76

圖1 癌組織中PD-L1陽性表達(a)，癌旁組織中PD-L1陽性表達(b)，陰性對照(c)；腸癌組織A2aR陽性表達(d)，癌旁組織中A2aR陽性表達(e)，陰性對照(h)(PV×40)

2.2 PD-L1蛋白在大腸癌組織中的表達與臨床病理特征的關系 PD-L1蛋白在大腸癌組織中的陽性表達與Broders分級、侵襲深度、TNM分期、脈管侵犯有關，差異有統計學意義(P<0.05)，在高Broders分級、侵襲深度至漿膜外、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期以及存在脈管侵犯的病理特征中具有高表達；而與年齡、腫瘤直徑及淋巴結是否轉移無關，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 PD-L1蛋白在大腸癌組織中的表達與臨床病理特征的關系

2.3 PD-L1與A2aR在大腸癌組織中表達的關系 PD-L1與A2aR共同陽性表達37例，共同陰性表達16例，采用 Spearman進行相關性分析結果顯示，PD-L1與A2aR陽性表達呈現正相關性(r=0.305，P=0.019)。見表3。

表3 PD-L1與A2aR在大腸癌組織中表達的相關性 例

2.4 A2aR蛋白在大腸癌組織中的表達與臨床病理特征的關系 A2aR蛋白在大腸癌組織中的陽性表達與Broders分級、侵襲深度、淋巴結轉移、TNM分期、脈管侵犯有關(P<0.05)，其中，在高Broders分級、侵襲深度至漿膜外、發生淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期以及存在脈管侵犯的病理特征中具有高表達；而與年齡、腫瘤直徑無關，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 A2aR蛋白在大腸癌組織中的表達與臨床病理特征的關系

3 討論

腫瘤抗原激活T細胞活性和免疫應答包括2個信號通路，即通過由組織相容性復合體-抗原肽復合物、共刺激或共抑制蛋白分子與T細胞的相互作用來實現，兩者缺一不可，否則會導致T細胞活化及失活狀

態失衡，造成T細胞免疫效應下降甚至細胞凋亡[8]。其中，共刺激或共抑制蛋白分子稱為免疫檢查點，包括CD28/B7家族成員。近年來，隨著臨床對免疫檢查點阻滯劑的不斷深入研究，通過抑制免疫檢查點來重建機體對腫瘤的免疫應答體系，為臨床治療晚期惡性腫瘤提高了新方法，在晚期惡性腫瘤的治療中起到較大的作用[9,10]。

PD-L1又稱為B7-H1，為B7家族重要成員之一，也是程序性細胞死亡因子PD-1的兩種配體之一，是負責腫瘤免疫應答調節的重要負性因子。癌組織中的PD-L1蛋白通過與NK 、T及B淋巴細胞中PD-1進行結合進行PD-1/PD-L1結合體，激活CD28/B7相關信號通路，引發T、B淋巴細胞免疫調節功能障礙，誘發IL-10等炎性因子生成，保護腫瘤自身細胞受到CTL介導的免疫攻擊，從而為腫瘤的生長創造條件[11]。臨床研究表明，近年來，由PD-1/PD-L1通路介導下的免疫抑制在乳腺癌、腎癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤的發展中均具有重要的作用，PD-L1在以上各種癌組織中均具有高表達，且PD-L1的陽性表達與腫瘤大小、轉移情況、分化程度及遠期生存率存在密切關系[12-14]。本研究結果顯示，PD-L1在大腸癌組織中的陽性表達率明顯高于其腸癌旁組織(P<0.05)，結果提示，PD-L1可能在大腸癌的發生和發展過程中具有關鍵作用。此外，本研究通過對不同病理特征癌組織中PD-L1表達情況的分析結果顯示，PD-L1在Broders分級及TNM分期越高、侵襲深度越深以及發生脈管侵犯的病理特征中表達水平越高(P<0.05)。因此，通過對PD-L1表達水平的檢測，有助于了解大腸癌病情進展，在臨床診斷和治療中具有重要意義。

有學者指出，A2aR與PD-L1存在一定的相關性[19]，通過阻斷 A2aR的表達可起到增強抗PD-1/PD-L1信號通路的作用，進而減低腫瘤發生轉移和浸潤的幾率[20]。因此，我們設想能否通過分析A2aR與PD-L1兩者的關系給大腸癌臨床診斷和治療提供一定指導依據。本研究結果中，A2aR與PD-L1均在分化程度、病理分期、侵襲深度等大腸癌組織中具有高表達，應用Spearman對進行相關性分析結果顯示，A2aR與PD-L1在大腸癌組織中的陽性表達呈現正相關性(P<0.05)。結果提示，A2aR與PD-L1可能在大腸癌的發展中存在某種協調作用，其具體作用機制有待臨床進一步深入研究。

綜上所述，A2aR與PD-L1在大腸癌組織中均具有高表達，與癌組織分期、分化程度、侵襲深度以及脈管侵犯有關，通過對兩者的監測，可為大腸癌的臨床診斷、治療及預后提供一定的指導依據。