miR-1224-5p靶向調控HMOX1基因對心肌細胞缺血再灌注損傷的影響

代天 楊萍 劉波 張蘇川

急性心肌梗死是引起人類死亡的常見的心血管疾病，其治療原則是恢復缺血心肌的血流灌注[1]，但這同時也會加重心肌結構和功能的損傷，從而引起心功能降低、惡性心率失常等，即心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[2]。目前，臨床治療心臟缺血過程中，I/R損傷是一大難題。所以，探討心肌I/R損傷的發病機制并在恢復血流灌注時減輕或者清除I/R損傷具有深遠的現實意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，其在心血管系統中的作用一直被廣泛研究。如Zhang等[3]研究顯示，I/R損傷后的H9C2細胞中miR-208a升高，促進miR-208a表達可增強細胞損傷并促進細胞凋亡。miR-1224-5p是miRNA家族成員，其參與細胞增殖、凋亡、氧化應激等過程[4,5]。但目前，miR-1224-5p對I/R損傷的影響還未知。StarBase在線網站預測顯示，血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)是miR-1224-5p的靶基因。HMOX1是血紅素降解的起始酶和限速酶，在心肌I/R損傷中發揮保護作用[6]。本研究通過體外培養心肌細胞H9C2并模擬I/R損傷，探討miR-1224-5p對心肌I/R損傷的影響及其是否通過調控HMOX1表達發揮作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與實驗試劑 大鼠心肌細胞H9C2，中國科學院上海生命科學研究所；胎牛血清(Fet al Bovine Serum，FBS)，杭州四季青公司；DMEM培養基，美國Gibco公司；胰蛋白酶和四甲基噻唑藍染色法(methylthiazoletrazolium，MTT)，美國Sigma公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，深圳晶美公司；HMOX1抗體，上海允麥生物科技有限公司；LiPofectamineTM 2000試劑盒，美國Invitrogen公司；miR-144-3p模擬物(mimics)、抑制劑及陰性對照，廣州銳博生物有限公司；PCR引物序列，上海吉瑪公司；BCA蛋白測定試劑盒，北京索萊寶公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，美國Promega公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒，南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI試劑盒，艾美捷科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染:復蘇大鼠心肌細胞H9C2，加入含10% FBS的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2、97%濕度的培養箱中培養。根據細胞生長狀況，每2～3天更換1次新鮮的培養基。待細胞融合至80%～90%時，加入適量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞。吸棄PBS，加入0.25%胰蛋白酶溶液，消化后傳代培養。對數生長期的H9C2細胞，以5×104個細胞接種于24孔板中。細胞融合至60%時，參照LiPofectamineTM 2000試劑盒操作說明書，分別轉染miR-1224-5p 抑制劑(anti-miR-1224-5p組)、抑制劑陰性對照(anti-miR-con組)、共轉染miR-1224-5p 抑制劑與HMOX1小干擾RNA的si RNA(anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組)、miR-1224-5p 抑制劑與小干擾RNA的si RNA陰性對照(anti-miR-1224-5p+si-con組)。轉染48 h后，收集細胞，用于后續實驗。

1.2.2 IR損傷模型建立和細胞分組:未轉染的H9C2細胞、anti-miR-1224-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組、anti-miR-1224-5p+si-con組細胞接種于96孔板中，每孔5×103個細胞。細胞貼壁后，參照文獻方法模擬IR損傷[7]：吸棄原培養，換用缺血緩沖液(pH值6.5)，置于37℃、21% O2、5% CO2培養箱中孵育2 h。然后換用正常培養基，在常規培養箱中再灌注4 h。細胞依次記為I/R損傷組(I/R組)、I/R+anti-miR-con組、I/R+anti-miR-1224-5p組、I/R+anti-miR-1224-5p+si-con組、I/R+anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組。同時設置對照組(Control組)：細胞不做任何處理，常規培養。

1.2.3 細胞活性檢測:細胞按照1.2.2分組處理后，每孔加入20 μl的MTT(5 g/L)，繼續孵育4 h。吸棄培養基，加入150 μl二甲基亞砜，反應5 min，振蕩混勻后于酶標儀490 nm處測定吸光度值(A)。細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.4 細胞凋亡率檢測:細胞按照1.2.2分組處理后，吸取細胞培養上清液，3 500 r/min離心10 min，-20℃保存備用。PBS清洗細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明書，加入400 μl結合緩沖液，移液器輕輕吹打，混懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC，37℃避光反應10 min。再加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，37℃避光反應5 min。最后加入100 μl結合緩沖液，混勻后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 酶聯免疫法檢測SOD、MDA、LDH和AST水平:采用酶聯免疫吸附法檢測1.2.4保存的細胞培養上清液，分別按照SOD、MDA、LDH和AST試劑盒操作說明書檢測其水平變化。

1.2.6 qRT-PCR檢測miR-1224-5p表達:4組細胞加入Trizol試劑，提取細胞中總RNA。微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度后，逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。引物序列：miR-1224-5p上游5’-TGCGCGTGAGGACTCGGGA-3’，下游5’-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3’；內參U6上游5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游5’-AAATATGGAACGCTTCAA-3’。PCR擴增程序：95℃ 5 min(1個循環)，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s(35個循環)。以U6為內參，2-ΔΔCt法計算miR-1224-5p的相對表達水平。

1.2.7 Western Blot法檢測HMOX1蛋白表達:收集4組細胞，RIPA試劑，提取細胞中總蛋白。BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。取一定量的蛋白溶液，加入上樣緩沖液，沸水中煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后，濕轉法轉至硝酸纖維素膜，于5%脫脂奶粉溶液封閉1 h。加入HMOX1抗體(稀釋度1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次。加入辣根過氧化酶標記的羊抗鼠二抗IgG(稀釋度1∶1 000)，37℃孵育1 h。TBST再次洗膜后，加入化學發光試劑ELC進行避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-1224-5p與HMOX1靶向關系:starBase在線網站預測顯示，HMOX1的3’-非翻譯區(3’UTR)存在miR-1224-5p的結合位點。構建HMOX1的3’UTR野生型(WT)熒光素酶載體pGL3-HMOX1-WT和突變型(MUT)熒光素酶載體pGL3-HMOX1-MUT。采用LiPofectamineTM2000試劑盒將pGL3-HMOX1-WT與miR-1224-5p mimics或miR-con、pGL3-HMOX1-MUT與miR-1224-5p mimics或miR-con共轉染至H9C2細胞。轉染48 h后，使用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組的熒光素酶活性。結果以熒光蟲活性/海腎熒光強度比值表示各組的熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-1224-5p在I/R心肌H9C2細胞中的表達及轉染效果比較 與Control組比較，I/R組miR-1224-5p水平升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+anti-miR-con組miR-1224-5p水平無明顯變化(P>0.05)，I/R+anti-miR-1224-5p組miR-1224-5p水平降低(P<0.05)。與I/R+anti-miR-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p組miR-1224-5p水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 miR-1224-5p在I/R心肌細胞H9C2中的表達及轉染效果

2.2 miR-1224-5p對I/R心肌細胞H9C2存活率和凋亡的影響 與Control組比較，I/R組H9C2細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+anti-miR-con組H9C2細胞存活率和凋亡率無明顯變化(P>0.05)，I/R+anti-miR-1224-5p組H9C2細胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)。與I/R+anti-miR-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p組H9C2細胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 miR-1224-5p對I/R心肌細胞存活率和凋亡的影響

圖1 miR-1224-5p對I/R心肌細胞凋亡的影響

2.3 miR-1224-5p對I/R心肌細胞氧化應激水平和心肌酶活性的影響 與Control組比較，I/R組SOD水平降低(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+anti-miR-con組SOD、MDA、LDH和AST水平均無明顯變化(P>0.05)，I/R+anti-miR-1224-5p組SOD水平升高(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平降低(P<0.05)。與I/R+anti-miR-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p組SOD水平升高(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 miR-1224-5p對I/R心肌細胞氧化應激水平和心肌酶活性的影響

2.4 miR-1224-5p靶向抑制HMOX1的表達 starBase在線網站預測顯示，HMOX1的3’UTR存在miR-1224-5p的結合位點。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，miR-1224-5p+HMOX1(WT)組的熒光素酶活性顯著低于miR-con+HMOX1(WT)組(P<0.05)，miR-1224-5p+HMOX1(MUT)組的熒光素酶活性與miR-con+HMOX1(MUT)組比較差異物統計學意義(P>0.05)，表明miR-1224-5p可與HMOX1的3’UTR的靶向結合。Western blot進一步檢測顯示，miR-1224-5p組HMOX1蛋白水平低于miR-con組(P<0.05)。見圖2、3，表4、5。

圖2 miR-1224-5p與HMOX1的結合位點

圖3 western blot檢測心肌細胞中miR-1224-5p的表達對HMOX1表達的影響；1 Control組；2 miR-con組；3 miR-1224-5p組

表4 雙熒光素酶活性檢測心肌細胞中miR-1224-5p與HMOX1的靶向關系

表5 western blot檢測心肌細胞中miR-1224-5p的表達對HMOX1表達的影響

2.5 HMOX1逆轉miR-1224-5p對I/R心肌細胞損傷的促進作用 與I/R+anti-miR-1224-5p組比較，I/R+anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組HMOX1水平降低，H9C2細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，SOD水平降低(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平升高(P<0.05)，而I/R+anti-miR-1224-5p+si-con組各檢測指標均無明顯變化(P>0.05)。與I/R+anti-miR-1224-5p+si-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組HMOX1水平降低，H9C2細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，SOD水平降低(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平升高(P<0.05)；I/R+anti-miR-1224-5p組各檢測指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4，表6、7。

圖4 western blot檢測3組細胞中HMOX1的表達；1 I/R+anti-miR-1224-5p組；2 I/R+anti-miR-1224-5p+si-con；3 I/R+anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組

表6 HMOX1逆轉miR-1224-5p對I/R心肌細胞細胞存活率和凋亡的影響

表7 HMOX1逆轉miR-1224-5p對缺血再灌注心肌細胞氧化應激水平和心肌酶活性的影響

3 討論

氧化應激是心肌I/R損傷發生發展的重要病理基礎，I/R損傷發生時，機體內氧化/抗氧化功能失調，自由基清除能力降低，體內氧化應激加劇，造成心肌損傷加重[8]。抑制氧化應激誘導的心肌細胞凋亡可有效降低I/R損傷。SOD是一種抗氧化酶，可有效清除自由基。MDA是脂質過氧化產物之一，可反映機體內脂質過氧化程度，可間接反映機體組織細胞受損程度。心肌酶是心肌細胞缺血缺氧時發生明顯變化的標志物，LDH和AST常用作I/R損傷的檢測指標[9]。LDH是心肌細胞特異性表達的酶，存在于心肌細胞胞質中。心肌細胞受損時，LDH大量釋放進入血液，其水平越高，說明I/R損傷越嚴重[10]。AST在心肌細胞中廣泛表達，與LDH相同，心肌損傷時，大量釋放進入血液。本研究結果顯示，心肌細胞H9C2發生I/R時，細胞存活率降低，凋亡率和MDA、LDH和AST水平升高，而SOD活力降低，與相關研究結果[11,12]一致。

miRNA通常與靶mRNA的3’UTR結合或降解靶mRNA，在轉錄后水平調控基因的表達，參與各種疾病的發生發展[13]。miRNA參與心肌I/R損傷發生發展過程，可作為IR損傷的特定標志物，在臨床診斷和治療中具有廣闊的應用前景[14,15]。研究顯示，miR-1224-5p參與調控瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和凋亡[16]；抑制miR-1224-5p表達可減弱二氧化硅誘導的體內肺纖維化[17]。目前，miR-1224-5p對I/R的影響及作用機制還未知。本研究結果顯示，I/R處理可促進心肌細胞H9C2中miR-1224-5p表達，提示miR-1224-5p可能參與I/R損傷發生發展。轉染anti-miR-1224-5p抑制H9C2細胞中miR-1224-5p表達后，與I/R+anti-miR-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p組H9C2細胞存活率明顯升高，凋亡率明顯降低，提示抑制miR-1224-5p表達可促進心肌細胞增殖，并抑制細胞凋亡。同時，抑制miR-1224-5p表達后，I/R處理的H9C2細胞MDA、LDH和AST表達明顯降低，SOD活力升高，提示抑制miR-1224-5p表達可能通過抗氧化應激減輕I/R誘導的心肌細胞損傷。

為了進一步探討miR-1224-5p影響心肌I/R細胞的作用機制，本研究通過在線生物信息學軟件預測顯示，HMOX1的3’UTR存在miR-1224-5p的結合位點，提示HMOX1是miR-1224-5p的靶基因。雙熒光素酶活性檢測和Western blot檢測證實HMOX1是miR-1224-5p的靶基因，并且miR-1224-5p負調控HMOX1表達。HMOX1是血紅素加氧酶的一種亞型，具有廣泛的生理作用。HMOX1是心肌中一種重要的內源性保護因子，其表達增加可抑制心肌細胞凋亡[18]。研究顯示，丹參水溶性提取物可激活心肌細胞HMOX1蛋白的表達，保護心肌細胞氧化應激損傷[19]。蘆丁可通過提高大鼠心肌組織HMOX1的表達對心肌缺血再灌注發揮保護作用[20]。本研究結果顯示，抑制HMOX1表達逆轉了抑制miR-1224-5p表達對I/R心肌細胞增殖、凋亡及氧化應激指標MDA、LDH、AST和SOD表達的影響，說明抑制miR-1224-5p表達通過上調HMOX1表達對心肌細胞I/R發揮保護作用。

綜上所述，抑制miR-1224-5p表達可保護心肌細胞I/R損傷，其作用機制與上調HMOX1表達有關，是缺血性心臟疾病治療的的潛在靶點。但是心肌I/R損傷的作用機制較為復雜，miR-1224-5p信號通路可能不只miR-1224-5p/HMOX1途徑，還需要進一步深入探討研究。