LAD1和P-ERK在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達及臨床意義

安淑香　雷麗　趙丹

【摘要】 目的：研究LAD1和P-ERK蛋白在乳腺組織中的表達，探討LAD1和P-ERK蛋白在乳腺浸潤性導管癌發展及預后中的作用。方法：選取2013年1月-2014年12月于本院進行手術治療的20例乳腺導管原位癌患者及其導管原位癌組織、癌旁正常組織標本，另選取同期80例乳腺浸潤性導管癌患者及其組織標本。采用免疫組織化學方法檢測并比較LAD1和P-ERK蛋白在癌旁正常、導管原位癌及浸潤性導管癌組織中的表達。比較不同臨床病理特征的浸潤性導管癌組織中LAD1和P-ERK的表達。分析浸潤性導管癌組織中LAD1和P-ERK表達的相關性。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線比較不同LAD1和P-ERK表達的乳腺浸潤性導管癌患者的生存情況。結果：乳腺導管原位癌、乳腺浸潤性導管癌組織中LAD1和P-ERK蛋白陽性表達率均高于癌旁正常組織（P<0.05）。不同組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移情況浸潤性導管癌患者LAD1蛋白和P-ERK蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;不同年齡、腫瘤大小及ER、PR表達情況者LAD1蛋白和P-ERK蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。乳腺浸潤性導管癌組織中LAD1和P-ERK表達之間呈正相關（P<0.05）。LAD1表達陽性的乳腺浸潤性導管癌患者5年生存率為66.0%低于LAD1陰性患者的90.0%（P<0.05）。P-ERK表達陽性的乳腺浸潤性導管癌患者5年生存率為67.9%低于P-ERK陰性患者的91.7%（P<0.05）。結論：LAD1和P-ERK的過表達在乳腺癌的發展及浸潤轉移中協同發揮重要作用，并與患者的不良預后有關。

【關鍵詞】 LAD1 P-ERK 乳腺浸潤性導管癌

[Abstract] Objective： To study the expression of LAD1 and P-ERK protein in breast tissue， and to explore the role of LAD1 and P-ERK protein in the development and prognosis of breast infiltrating ductal carcinoma. Method： A total of 20 cases of ductal carcinoma in situ patients and their ductal carcinoma in situ tissues and adjacent normal tissue specimens who underwent surgical treatment in our hospital from January 2013 to December 2014 were selected， and another 80 cases of infiltrating ductal carcinoma of breast and their tissue specimens were selected during the same period. Immunohistochemical method was used to detect and compare the expression of LAD1 and P-ERK protein in adjacent normal， ductal carcinoma in situ and infiltrating ductal carcinoma. The expressions of LAD1 and P-ERK in infiltrating ductal carcinoma with different clinicopathologic features were compared. The correlation between LAD1 and P-ERK expression in infiltrating ductal carcinoma was analyzed. Survival curve was drawn by Kaplan-Meier method to compare the survival of patients with infiltrating ductal carcinoma with different LAD1 and P-ERK expression. Result： The positive expression rates of LAD1 and P-ERK in ductal carcinoma in situ and infiltrating ductal carcinoma of breast were higher than those in adjacent normal tissues （P<0.05）. The positive expression rates of LAD1 protein and P-ERK protein in breast infiltrating ductal carcinoma patients with different histological grade， clinical stage and lymph node metastasis were statistically significant （P<0.05）; there were no significant differences in the positive expression rates of LAD1 and P-ERK protein among different age， tumor size and ER and PR expression （P>0.05）. There was a positive correlation between LAD1 and P-ERK expression in infiltrating ductal carcinoma of breast （P<0.05）. The 5-year survival rate of infiltrating ductal carcinoma patients with LAD1 positive expression was 66.0% lower than 90.0% of LAD1 negative expression patients （P<0.05）. The 5-year survival rate of infiltrating ductal carcinoma patients with P-ERK positive expression was 67.9% lower than 91.7% of P-ERK negative expression patients （P<0.05）. Conclusion： The over expressions of LAD1 and P-ERK might play an important role in progression， invasion and metastasis of breast cancer， and related to the poor prognosis of the patient.

[Key words] LAD1 P-ERK Breast infiltrating ductal carcinoma

First-author’s address： Fuxin Center Hospital， Fuxin 123000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.22.007

細胞骨架是一系列細胞結構蛋白的統稱，它們不僅為細胞塑形，更在細胞的通訊、遷移、浸潤轉移中發揮著重要的作用，細胞骨架蛋白如微管蛋白抑制劑可用于癌癥的治療[1-2]。LAD1是一個細胞骨架相關蛋白，蛋白分子量59 kD，LAD1首先從小鼠皮膚cDNA文庫中克隆，除了富含精氨酸的N端延伸序列和6個絲氨酸-谷氨酸-賴氨酸（SEK）三肽基序以外，編碼的蛋白質沒有可識別的結構域，其可作為基底膜的分泌成分。人類LAD1基因位于染色體1號上，其外顯子區域在哺乳動物中保存良好[3]。關于其報道的內容不多，較早的研究報道與正常卵巢上皮相比，LAD1是卵巢漿液性乳頭狀癌中表達最高的基因之一[4]。最新的研究發現，LAD1和人的惡性侵襲性乳腺腫瘤相關，LAD1蛋白是媒介EGF激活ERK信號通路的重要因子[5]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑中的細胞外激酶（ERK）是MAPK家族的重要成員，P-ERK是ERK的活化形式，ERK信號途徑以正調節的方式調控腫瘤生長并可用于腫瘤的治療[6-7]。LAD1蛋白與ERK信號通路相關，在乳腺癌組織中LAD1是否通過調節活化ERK途徑發揮作用，兩者在乳腺癌組織中的表達是否存在一定的相關性并協同發揮作用具有研究意義。本研究分析了LAD1和P-ERK在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達及臨床意義，旨在為乳腺癌的研究開辟新途徑，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月-2014年12月于本院進行手術治療的20例乳腺導管原位癌患者及其導管原位癌組織、癌旁正常組織標本，另選取同期80例乳腺浸潤性導管癌患者及其組織標本。納入標準：均已確診為乳腺導管原位癌與乳腺浸潤性導管癌;女性，年齡25～70歲;入組前無放療、化療、免疫及內分泌治療史。排除標準：患有其他系統惡性腫瘤病史;患有嚴重內外科疾病;臨床資料不完整。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書，本研究已經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 （1）實驗試劑。LAD1兔多克隆抗體（PA5-55966）購買自Thermo Fisher Scientific、P-ERK鼠單克隆抗（sc-7383）購自 Santa CruzBiotech Inc。S-P 超敏免疫組化試劑盒、DAB 酶底物顯色試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。（2）LAD1和P-ERK蛋白的表達。標本經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，采用免疫組織化學（SP）法，按試劑盒說明書步驟進行抗LAD1（1︰500）、P-ERK（1︰200）抗體免疫組織化學染色，PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。結果判定：LAD1蛋白陽性表達位于乳腺癌細胞質和膜內，P-ERK蛋白陽性表達主要分布于乳腺癌細胞質。每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞，0分，無陽性細胞;1分，陽性細胞<25%;2分，陽性細胞25%～50%;3分，陽性細胞51%～75%;4分，陽性細胞>75%。染色強度評分，0分為無陽性細胞;1分為淺黃色;2分為黃色;3分為棕黃色。陽性細胞數評分與染色強度評分相乘后得出綜合評分。綜合評分>3為陽性表達[8]。（3）隨訪。80例浸潤性導管癌患者術后進行5年定期隨訪，隨訪開始時間為接受手術時間，截止時間為2019年12月。采用門診隨訪及電話隨訪，平均每6個月隨訪1次，終止時間為患者死亡時間，中途失訪者的終止時間為最后1次隨訪時間。

1.3 統計學處理 采用SPSS 25.0軟件對所得數據進行統計分析;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗;LAD1和P-ERK的相關性用Pearson列聯系數;Kaplan-Meier法繪制生存曲線及log-rank檢驗進行生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 20例乳腺導管原位癌患者與80例乳腺浸潤性導管癌患者一般資料比較 乳腺導管原位癌患者年齡≤45歲者9例，年齡>45歲者11例;腫瘤直徑<2 cm者7例，>2 cm者13例。乳腺浸潤性導管癌患者年齡≤45歲者32例，年齡>45歲者48例;腫瘤直徑<2 cm者30例，>2 cm者50例。依據WHO2012年所推薦的乳腺腫瘤標準進行分級、分期，并結合第5版WHO乳腺腫瘤分類解讀[9]，組織學分級：Ⅰ級6例，Ⅱ級48例，Ⅲ級26例;臨床分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期43例，Ⅲ、Ⅳ期32例;有淋巴結轉移46例，無淋巴結轉移34例。兩種乳腺腫瘤患者年齡與腫瘤直徑比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。

2.2 LAD1和P-ERK蛋白在不同乳腺組織中的表達 LAD1蛋白在癌旁正常組織主要表達于細胞膜，見圖1A;乳腺導管原位癌、乳腺浸潤性導管癌組織中LAD1蛋白主要表達于細胞質和細胞膜內，呈棕黃色顆粒，見圖1C、E。P-ERK蛋白在癌旁正常組織主要表達于細胞質，見圖1B;乳腺導管原位癌、乳腺浸潤性導管癌P-ERK蛋白主要表達于細胞質，見圖1D、F。乳腺導管原位癌、乳腺浸潤性導管癌組織LAD1和P-ERK蛋白表達陽性率均高于癌旁正常組織（字2=3.956、11.634、7.033、20.008，P=0.047、0.001、0.008、0.000）;浸潤性導管癌組織中LAD1和P-ERK蛋白表達陽性率雖高于導管原位癌，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 不同臨床病理特征的浸潤性導管癌組織中LAD1和P-ERK的表達 不同組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移情況者LAD1蛋白和P-ERK蛋白表達陽性率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。不同年齡、腫瘤大小及ER、PR表達情況者LAD1蛋白和P-ERK蛋白表達陽性率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.4 乳腺浸潤性導管癌組織中LAD1和P-ERK表達的關系 LAD1和P-ERK表達均為陽性的標本共41例，表達均為陰性的標本共15例，具體表達情況見表3。乳腺浸潤性導管癌組織中LAD1和P-ERK表達之間呈正相關（r=0.320，P=0.002）。

2.5 不同LAD1和P-ERK表達的乳腺浸潤性導管癌患者5年生存率比較 Kaplan-Meier生存分析顯示，LAD1表達陽性的患者5年生存率為66.0%低于LAD1陰性患者的90.0%，差異有統計學意義（字2=5.691，P=0.017）。P-ERK表達陽性的患者5年生存率為67.9%低于P-ERK陰性患者的91.7%，差異有統計學意義（字2=4.679，P=0.031）。見圖2。

注：A為LAD1在癌旁正常組織中的表達;B為P-ERK在癌旁正常組織中的表達;C為LAD1在導管原位癌組織中的表達;D為P-ERK在導管原位癌組織中的表達;E為LAD1在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達;F為P-ERK在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，EGFR激活的信號通路能夠提高細胞的遷移能力，在腫瘤的進展研究中得到證實[10-11]。因此有研究利用磷酸化蛋白組學技術對接受EGF刺激的乳腺細胞系進行了分析，發現一種名為LAD1的蛋白是媒介EGF激活ERK信號通路的重要因子，在這個過程中LAD1不但蛋白產量升高，還會發生結構修飾，然后和其他重要的細胞骨架蛋白肌動蛋白（actin）等一起參與調節乳腺細胞的增殖和侵襲，在乳腺癌的進展中發揮重要作用[5]。且有基因學研究發現LAD1在基底細胞樣和三陰性乳腺癌中表達，提示LAD1與乳腺癌的惡性度相關，其高表達患者可能預后不良[12-13]。在甲狀腺癌的研究中發現LAD1基因特異表達于BRAF V600E突變的腫瘤[14]。且有研究報道LAD1在口腔鱗癌、喉癌中高表達，并在腫瘤的轉移中發揮作用，提示LAD1與腫瘤的發生發展存在重要作用[15-16]。LAD1的DNA甲基化可作為腎細胞癌預后的標志物[17-18]。但關于其在腫瘤組織中的研究報道較少，在乳腺癌組織中LAD1蛋白存在怎樣的表達目前國內還未見相關報道。

MAPK家族成員中的ERK，包括ERK1/2，P-ERK是ERK活化形式，研究已證明活化的ERK在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用[19-20]。LAD1能夠活化ERK信號轉導通路，那么兩者是否協同在乳腺癌的進展中發揮作用，LAD1和P-ERK在乳腺癌組織中的表達存在怎樣的關聯？本研究發現，LAD1和P-ERK在癌旁正常組織中少量表達，在乳腺導管原位癌、乳腺浸潤性導管癌中高表達，且呈遞增趨勢;LAD1和P-ERK的蛋白表達和組織學分級存在相關，且組織學分級越高，蛋白表達陽性率越高;兩種蛋白表達和臨床分期及淋巴結轉移存在相關，Ⅲ、Ⅳ期乳腺浸潤性導管癌患者兩種蛋白表達陽性率均高于Ⅰ、Ⅱ期患者;有淋巴結轉移者兩種蛋白表達高于無淋巴結轉移者。本研究結果顯示，在乳腺浸潤性導管癌組織中LAD1和P-ERK表達均為陽性的標本共41例，表達均為陰性的標本共15例，兩者表達存在正相關（P<0.05）。提示LAD1在乳腺癌的發展中發揮重要作用，LAD1作為P-ERK的上游因子可能通過調控ERK的表達從而在乳腺癌的發展中發揮作用。生存分析發現，LAD1和P-ERK表達陽性乳腺浸潤性導管癌患者的術后5年生存率低于表達陰性者（P<0.05）。

綜上所述，LAD1在乳腺浸潤性導管癌組織中高表達，與P-ERK的表達存在正相關，兩者在乳腺癌的進展中發揮協調作用，并與乳腺癌患者的預后生存期相關，有望成為乳腺癌診治和預后的生物學標志物。關于LAD1的研究較少，深入研究LAD1及其上下游調控因子可為乳腺癌的靶基因治療提供新的思路。

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（收稿日期：2021-04-20） （本文編輯：田婧）