牛結核病診斷技術研究進展

羅鵬飛，王金泉，舒 展

(1.新疆阿勒泰地區動物疾病控制與診斷中心，新疆 阿勒泰 836500；2.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

牛結核病是由牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis,M bovis)和結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一種慢性消耗性人獸共患傳染病，袁溶英(2019年)研究了牛結核病臨床癥狀，其臨床上一般難以發現典型癥狀和病變[1]。Vordermeier H M等學者(2016年)報道，全球牛結核病流行率為9%[2]，陳淑瓊等學者(2014年)報道，全球畜牧業發展中約有5 000萬頭牛患有結核病[3]，張喜悅等學者(2015年)研究發現，我國個別地區牛群中牛的感染率達9.6%[4]；Vordermeier H M等學者(2016年)報道，全球每年因該病造成的經濟損失高達30億美元[2]。張高迪等學者(1996年)通過試驗發現，牛結核中有7%系人分枝桿菌感染，而結核病人中10.6%為牛分枝桿菌感染[6]。才吉(2020年)報道，通過世界衛生組織的實際調查，平均每年會有300萬人因患有牛結核病而死亡，不僅對世界經濟發展造成了嚴重影響，而且還對人類生命健康造成嚴重威脅[7]。潘福寶等學者(2019年)研究發現，我國人畜結核病雖然在一定時期內得到了控制，但是根據近年來的相關數據顯示，該病的發病率又呈現出增長趨勢，應該引起高度重視，需要做好防控[8]。

1 概 述

張秀華等學者(2005年)報道，牛結核病是養牛過程中較為常見的一種人畜共患性慢性消耗性傳染病[9]，其病原是分枝桿菌屬的3個種，即牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和禽型分枝桿菌(Mycobacterium avium)。本病會引起牛只多種組織以及器官內出現結節性肉芽腫和干酪性壞死灶，導致機體出現慢性消耗性疾病，病牛普遍壽命縮短，患病奶牛產奶量明顯減少甚至出現不孕癥狀。奶牛是最易感染結核病的家畜，病牛的鼻液、痰液、糞便和乳汁等均可通過空氣、經口、撕咬以及垂直傳播的方式將疾病傳播給人類以及其他動物，引發相關感染。懷孕的母牛可以經過胎盤傳播給胎兒，造成新生犢牛感染結核桿菌。

牛結核病具備較廣的感染宿主，絕大多數溫血脊椎動物均可感染。人主要是通過消化道被感染，如吃未經檢疫或檢疫不合格的結核病患牛的肉制品，飲用未經巴氏消毒或煮沸的結核病患牛的奶制品，某些養殖場為減少經濟損失會將病牛的牛奶喂牛犢造成犢牛感染。人在感染此病之后，會出現消瘦、咳嗽、呼吸困難，嚴重者則會因為心肺衰竭而突然死亡。其中，以牛結核病對人類健康的危害性最大也最難控制，尤其是未經消毒的奶制品，更應該引起重視，杜絕此類產品流入市場，導致感染。因此，牛結核病對畜牧養殖業的穩定健康發展、對公共衛生安全和人類身心健康都會造成嚴重影響，應該高度重視。

2 牛結核病基因分型

1998年，通過公布結核分枝桿菌H37RV基因組序列的初步分析結果，表明結核桿菌研究進入到了結構以及功能基因組學時代。通過構建牛結核桿菌基因文庫，方便分離基因，采取適宜的探針通過分子雜交等即可篩選目的基因。利用牛結核桿菌基因文庫來鑒定牛結核桿菌基因及抗原，并對其特征進行分析，即可實現有效的診斷。鄭素華等學者(2003年)研究了牛結核分枝桿菌多肽抗原，通過比較結核分枝桿菌以及牛結核分枝桿菌多肽抗原發現，分子量為28 000、34 000以及40 000多肽為較特異性的多肽抗原成份[10]。

對基因組學進行比較是一種有效的鑒定遺傳變異的方法，通過遺傳變異可比較出生物體在生理、生化以及毒力等方面所存在的差異。通過公布結核桿菌全基因組序列，使人類得以利用定制的細菌人工染色體陣列作為模版，以不同結核桿菌全基因組作為探針來開展雜交試驗。

3 發病機制

牛結核感染最先導致原發病灶的形成，通常引起哺乳動物原發病灶區淋巴管附近的淋巴結產生干酪樣病變，這種原發病變對動物來說一般很難治愈。病原菌在侵害機體時，常常遭到吞噬細胞的吞噬，菌體類脂質可以對吞噬細胞溶酶體的作用進行有效對抗，在吞噬細胞內以細菌的形式寄生。接著形成帶菌免疫，這種帶菌免疫主要為細胞免疫，導致傳染性免疫以及傳染性變態反應的同時產生并且同時存在。何昭陽等學者(1994年)報道，在肉芽形成以后，隨著病情的發展逐漸轉變為腫瘤狀的結核結節增生，導致結節異常增大[11]。在肉芽的生長作用下，壞死灶逐漸蔓延至心肌部位，其中心部門逐漸縮小，同時因發生鈣化以及液化而轉變為呈干酪狀的團塊。哺乳動物體內的結核結節常常轉變為致密性的纖維組織，導致該病停止發展。在淋巴液以及血液的流動作用下，結核分枝桿菌發生轉移并且在其他器官以及組織中定居，導致其他結核結節區的形成，引起器官病變，雖然病變廣泛分布，但是在相當長的一段時間內其病理變化并不明顯，不存在任何臨床癥狀，隨著結核感染大量進入淋巴液以及血液，腎臟以及肺臟等主要器官中逐漸形成大量的結核結節時，這一過程就屬于致命的感染。從早期感染往往需要經過幾個月才能出現鈣化以及液化的干酪結節，宿主相關免疫應答反應機能、潛伏期內細菌的增值程度直接決定著該病的抑制、發展、病灶的蔓延擴大。

如果機體具備較強的抵抗力，吞噬細胞內的細菌就會在局部滯留導致原發性結核結節的出現，這種結節可能終身不擴散。但是如果機體抵抗力較弱，細菌常常在淋巴管的擴散作用下繼發結核結節病灶，在血液的作用下甚至導致全身性結核結節的出現。

4 流行病學

結核桿菌可以導致超過50種哺乳動物以及25種禽類發病。牛是最容易感染結核病的家畜之一，尤其是奶牛其發病率最高，其余分別為水牛以及黃牛，除了牛只以外，豬、家禽也容易感染結核桿菌，羊以及馬感染概率較低。在全世界范圍內牛結核病均有發生，該病的發生不存在明顯的季節流行性，常年可隨時發生。其主要傳染源為病牛，病牛呼吸道內的分泌物可以通過咳嗽傳播至空氣當中，或者隨著生殖器官分泌物、鼻液、乳汁、唾液、痰液等排出體外，對空氣、飲水以及飼料等造成污染。絕大多數情況下，成年牛通過被污染的塵埃或者飛沫而感染，犢牛則主要通過乳汁、飲水以及飼料等感染。

崔基賢等學者(2013年)報道，在全世界范圍內牛結核病均有發生，隨著消滅牛結核病計劃的順利實施，截至到當前美國基本已經不存在結核病牛群[12]。但是人類結核病、野生動物結核病以及觀賞動物結核病的存在，導致牛只隨時可能遭到感染，因而在美國牛結核病仍受到了較高的重視。2003年，我國從美國引入142頭良種奶牛當中廣東檢驗總局共檢驗出19例陽性種牛，使得美國25年來不存在牛結核病的神話徹底打破。

在我國，很早以前就有牛結核病的記載，尤其到了上世紀40年代以后，由于從國外大量引入奶牛，導致家畜結核病在我國廣泛流行。上世紀50年代我國大規模暴發牛結核病，通過人們的長期不斷努力，牛結核病陽性率明顯降低。到了70年代，我國奶牛產業得到了快速的發展，隨著養殖規模的不斷擴大，牛結核病廣泛流行，一些地區牛結核病陽性率甚至達到了64.7%。到了80年代，該病的流行逐漸放緩，但是其感染率仍然較高。在我國，牛結核病的發生造成了較為嚴重的經濟損失。

5 診斷方法

當前，國內外對于牛結核病的檢測方法主要包括細菌學檢驗、免疫學檢驗及分子生物學方法3種。

5.1 細菌學檢驗

Wolf A J等學者(2008年)研究了牛結核分枝桿菌的細菌學檢驗，首先為細菌培養以及涂片鏡檢等病原學檢查方法，這是較為常見的一種方法，但是結核菌需要8周左右這一較長時間內進行培養[13]。李樹春(2010年)研究報道，在進行牛結核分枝桿菌的細菌學檢驗時大約有10%～20%的病例存在培養失敗的問題[14]。與此同時，細菌培養的檢出率較低，其敏感性較差，加之郭海晏等學者(2002年)報道，其缺乏敏感性及特異性，無法使當前牛結核病的臨床診斷需求得到滿足[15]。

5.2 免疫學方法

免疫學方法是臨床診斷中得到廣泛應用的一種診斷方法，較為常見的為牛結核菌素PPD皮內變態反應試驗以及間接ELISA檢測方法，這兩種診斷方法敏感性較高，特異性較強，操作簡便，可以應用于牛結核病的普查。當前，牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗已經在牛結核病的檢疫診斷中得到了廣泛的應用。Cousins D V等學者(2001年)報道，ELISA法、PCR方法也是較為常見的一種實驗室診斷方法，雖然其操作較為便利，但是需要較高的檢測成本，因而很難實現有效的落實以及推廣[16]。

5.3 分子生物學方法

主要包括PCR、核酸探針以及DNA圖譜等分子生物學方法。這一類方法具備較強的敏感性以及特異性，但是其檢測過程中需要特殊的儀器設備，檢測技術性較強，操作過于復雜，對操作人員以及實驗室條件提出了較高的要求。因此，僅僅在實驗室研究有所應用，很難在基層推廣使用。

牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗雖然具備明顯的不足之處，但在實際生產應用當中，楊光旭等學者(2004年)報道，牛型結核菌素皮內變態反應是國家動物結核病檢疫行業標準[17]。當前，這種方法在動物結核病以及人結核病免疫診斷時得到了廣泛的應用。張玉環(2004年)報道，世界動物衛生組織(OIE)和我國都將此方法列為牛結核病檢疫的一個標準試驗[18]。ELISA方法以及抗體免疫金標方法等其他檢測牛血清抗體的方法，均因成本過高，同時操作不便，無法在獸醫臨床試驗得到有效應用。何昭陽等學者(1994年)比較了ELISA方法與變態反應方法檢測奶牛結核病的情況，得到的結論為：變態反應陽性并不能全包括ELISA陽性，變態反應與剖檢及細菌學檢查的符合率分別為18.8%和7.2%[19]。陳穎鈺等學者(2014年)報道，目前ELISA方法以及抗體免疫金標方法等其他檢測牛血清抗體的方法僅被作為牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗的輔助診斷方法[20]。

6 綜合防控

牛結核病作為重要的人畜共患傳染病，嚴重威脅著人類公共衛生健康安全，并制約著經濟社會的發展。牛型結核分枝桿菌潛伏期一般為10～45 d，有的可長達數月或數年，結核菌常隨鼻液、痰液、糞便和乳汁等排出體外，可通過空氣、飼料等傳染給健康牛。因此，對于牛結核病的防治，主要采取檢疫監管、分群隔離、撲殺陽性牛、凈化環境控制和發展健康牛群等方式進行。目前，多數國家都不提倡用疫苗接種的手段來控制牛結核病，而采用牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗初篩，許多發達國家就是利用體外檢測γ-干擾素法或PCR方法確診結核陽性牛。患結核病牛無法完全徹底治愈，同時能夠傳染給人，我國目前采取“檢疫-淘汰-撲殺”的防控措施，一旦檢測出結核病陽性牛，則采取撲殺無害化處理的方式進行。首先，必須加強動物疫病的監督管理力度，增強檢疫監管手段，凡跨區調運的牛只，必須具備調出地檢疫合格證明，一律進行不少于45 d的集中隔離觀察，檢疫合格后方可混群飼養。黃愛芳等學者(2011年)報道，健康奶牛的牛群每年應實施牛結核病檢疫2次；缺乏檢測條件的貧困地區和偏遠牧區，也應保證每年至少1次檢疫；假定健康牛只，應在每一年度進行4次以上的檢疫。一旦檢測發現陽性牛，必須及時撲殺并做無害化處理。健康牛場嚴禁引入感染地牛只，對牛場進行定期消毒，避免發生疫情[21]。

7 展 望

牛結核病作為一種慢性消耗性傳染病，其傳染性較強。近年來，我國養牛產業得到了迅速的發展，牛群數量的增加在一定程度上提高了各種傳染性疾病發生的概率，如果未及時采取行之有效的措施對人畜共患病進行綜合防控以及凈化，會在很大程度上威脅社會公共衛生安全。由于結核病存在細胞免疫和體液免疫分離現象，無論是牛型結核菌素PPP皮內變態反應試驗、γ-干擾素體外釋放試驗還是聚合酶鏈式反應(PCR)法都難以準確無誤地診斷牛結核病，目前確診牛結核病比較理想的方法是兩種或兩種以上方法的聯合使用。因此，今后除需要在使用現有方法或技術診斷牛結核的基礎上，繼續開展牛結核病診斷新方法、新技術的試驗研究，最大限度地提高診斷的準確性，尤其是在農牧區應用準確、高效、快速的牛結核病診斷方法或技術至關重要，開展牛結核病流行病學調查不僅可以幫助獸醫人員掌握牛結核病流行趨勢，還能有效預防該病的傳染。