新疆北疆地區規模化牛場傳染性犢牛腹瀉分析

居馬別克·夏拉巴依，馬曉艷，阿曼古麗·加孜，美熱木古麗·巴依待拉提，任 娟，王 文，李 舵

(1.新疆維吾爾自治區動物疾病預防控制中心，烏魯木齊 830011)

犢牛腹瀉是多種病因引起的一種臨床常見疾病，也是導致犢牛死亡的重要原因，可以概括的分為非傳染性腹瀉和傳染性腹瀉[1]。非傳染性腹瀉是由飼養管理不善、營養缺失、飼料調配不合理、飼料中毒、天氣變化和長途運輸等并非病原感染因素引起的腹瀉。傳染性腹瀉是由病毒(如冠狀病毒、輪狀病毒)、細菌(如產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌等致病菌)、寄生蟲(如微小隱孢子蟲、球蟲、線蟲)等病原體引起的腹瀉[2，3]。該病在犢牛中均為常見疾病，多發生于2月齡內的犢牛，造成1月齡以下犢牛死亡的主要原因之一，嚴重時可導致70%的犢牛發病，病死率高達50%[4，5]。本文選擇新疆北疆地區9個規模化牛場，開展牛傳染性犢牛腹瀉調查與實驗室檢測，分析牛場傳染性犢牛腹瀉發病情況，為臨床防治提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年10月31日至2019年6月20日，分別在新疆北疆伊犁州、阿勒泰、塔城每個區選擇2～3個規模化養牛場及養殖合作社，以詢問或查閱資料方式，填寫犢牛傳染性腹瀉流行病學調查情況表，重點采集新生犢牛有腹瀉，糞便呈稀軟、水樣狀態，后期食欲減退，難以站立或出現昏迷等癥狀的樣品，在伊犁州新源縣、塔城市、阿勒泰市的3個種牛場、6個規模場采集有上述癥狀的牛糞便或肛門拭子樣品共234份。

1.2 試劑和儀器

消化道ELISA抗原檢測試劑盒購自青島瑞爾生物技術有限公司，生產批號:DIG17K30；營養肉湯培養基、血瓊脂等培養基、蓋玻片、10種藥敏紙片購自烏魯木齊天和眾鑫商貿有限公司；麥康凱瓊脂、SS瓊脂、沙門氏菌顯色培養基、革蘭氏染色試劑盒、焦性沒食子酸購自烏魯木齊牧源康獸藥器械經銷部。

1.3 檢測方法

1.3.1 細菌培養

1.3.1.1 增菌培養 無菌抽取采集阿勒泰地區、伊犁州新褐牛場、塔城地區種牛場的犢牛糞便進行增菌培養，無菌取0.5 g接種至9 mL營養肉湯培養基，37℃培養12～24 h；同時挑取糞便，無菌取0.5 g接種至7 mL厭氣肝湯培養基，37℃培養24～48 h。24 h后觀察是否有菌落產生，如果有，再進行培養、純化。

1.3.1.2 鑒別培養基培養 繼續用接種環無菌取以上兩種培養后的增菌液，每份分別劃線接種在麥康凱瓊脂平板、血瓊脂平板和SS瓊脂平板，37℃培養24 h。

1.3.1.3 染色鏡檢 以上三種培養基上生長的典型菌落，用接種環取涂片革蘭氏染色后鏡檢觀察。

1.3.1.4 生化試驗 按照細菌微量生化反應管(購自杭州微生物試劑有限公司)，對分離到的菌株進行生化指標檢測，操作方法與判定結果參照說明書。

1.3.2 藥敏試驗

采用紙片法對分離到的致病菌進行10種常見抗生素藥敏紙片藥敏試驗。按照K-B法試驗要求，每張紙片間距不得少于24 mm，紙片中心距離平皿邊緣不少于15 mm。同時做兩個平板，進行重復試驗，平皿置于37℃培養箱中培養24 h，觀察記錄結果。

1.3.3 消化道ELISA與球蟲檢測

采集糞便樣品前處理，按照消化道ELISA抗原檢測試劑盒說明書操作，該試劑盒可以鑒別檢測輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌F5(K99)、微小隱孢子蟲，同時采集的樣品用漂浮法對樣品進行球蟲檢測。

2 結 果

近1年時間，奔赴新疆北疆三個地區，到伊犁州、塔城地區、阿勒泰地區的3個種畜場、6個規模場共9個場點，采集糞便234份，如下表1顯示。

2.1 牛場流行病學調查情況

根據規模化牛場流行病學調查情況分析發現，新疆北疆片區大部分規模牛場及養牛合作社都有犢牛腹瀉病例發生，發病率40%左右、死亡率14%左右。在9個牛場的1月齡以內的犢牛腹瀉2017年的發病率為45.64%，死亡率為13.67%，2018年的發病率為39.4%，死亡率為13.87%，2019年4個規模化牛場的1月齡以內的犢牛腹瀉發病率為32.86%，死亡率為14.14%。

2.2 細菌學檢測

2.2.1 細菌培養結果

24 h后觀察菌落形態，有138份樣品在麥康凱瓊脂平板上出現紅色或粉紅色菌落、有5份出現透明發白小菌落；有123份樣品在SS瓊脂平板上出現粉紅色菌落、有1份出現透明發白小菌落，麥康凱和SS瓊脂生長的發白小菌落在后期增菌培養沒有得到相應菌株，其余4份無菌落；在血瓊脂平板上有15份出現乳白色小菌落β溶血。

2.2.2 鏡檢

在3種鑒別培養基上挑取接種典型的菌落、將菌落涂片革蘭氏染色后鏡檢觀察，大多是短粗狀桿菌，從培養基生長特性和鏡檢結果可確定15株致病性大腸桿菌。如圖1-圖4。

圖1 麥康凱培養基菌落

圖2 SS瓊脂培養基菌落

圖3 致病菌在血瓊脂培養基菌落

圖4 顯微鏡觀察結果（大腸桿菌）

2.2.3 藥敏試驗結果

觀察藥敏片周圍有沒有肉眼可見生長物區域為抑菌圈，使用游標卡尺測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑大小判斷細菌對抗菌藥的敏感性(見表2)，結果分為高敏感、中敏感、耐藥。藥敏試驗結果是大腸桿菌對卡那霉素、磺胺嘧啶、頭孢噻呋敏感、替米考星和氟苯尼考中敏感，其它藥物都表現為耐藥。

表2 藥敏試驗判斷結果

2.3 消化道ELISA抗原檢測結果

由于采集樣品數量較多，挑取有臨床癥狀非常明顯的樣品，用消化道ELISA抗原試劑盒進行檢測。檢測試劑盒通過用腹瀉病病原特異性抗體包被96孔微量板，抗體可以捕獲糞便中相應的致病病原。

隨機選取不同采集點有腹瀉癥狀的234份樣品，經ELISA檢測，沒有檢測到冠狀病毒抗原，檢測到15份輪狀病毒抗原，檢測到20份微小隱孢子蟲抗原，檢測到7份大腸桿菌F5抗原。其中伊犁州的種牛場、規模場共47份樣品均沒有檢測到輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌F5、微小隱孢子蟲抗原，阿勒泰地區、塔城地區牛場檢出不同數量的大腸桿菌F5、微小隱孢子蟲抗原和輪狀病毒，其中微小隱孢子蟲檢出的陽性率最高，所有糞便樣品檢測結果如下表3、圖5所示。

圖5 北疆規模化牛場消化道ELISA抗原陽性率結果

表3 新疆北疆三個地區糞便樣品ELISA檢測結果（份）

3 討論與分析

犢牛傳染性腹瀉是危害犢牛的常見病之一，有明顯的季節性，常發于冬季和春季，還可以導致地方性流行［6，7］。本文流行病學調查發現阿勒泰地區有的規模化牛場夏季也有病例發生(10月份至次年的6月份)。

腹瀉犢牛臨床癥狀主要表現為出現白色或者黃色糞便，水樣棕色糞便為主，發生的日齡在1～28 d的范圍內。導致犢牛腹瀉的原因很多，其中大腸桿菌是犢牛腹瀉的主要原因之一。大腸桿菌作為腸道菌群的重要組成部分，一般是非致病的，一些特殊血清型的大腸桿菌可導致家畜的腹瀉及敗血，對家畜具有致病性［8，9］。大腸桿菌經藥敏試驗，挑選出卡那霉素、磺胺嘧啶、頭孢噻呋三種高敏感藥物，為臨床提供可行性治療藥物［10］。

從上述三個地區發病情況來看，阿勒泰地區犢牛腹瀉感染陽性率較塔城、伊犁州高，一方面是臨床獲取的樣本量少，臨床判定的疏漏和檢測方法的差異，不能整體反映三個地區各個牛場陽性率情況；另一方面是和養殖場飼養管理水平有關系，在飼養條件、圈舍消毒、殺蟲、疫病防治等方面都有所改善，犢牛傳染性腹瀉還需與其他常見病開展鑒別診斷。

4 結 論

本次調查新疆北疆規模化牛場牛傳染性腹瀉感染情況不容忽視，所有樣品經細菌培養檢測到大腸桿菌15株，經藥敏試驗，對磺胺嘧啶、卡那霉素、頭孢噻呋高敏感、替米考星和氟苯尼考中敏感，用消化道ELISA抗原試劑盒沒有檢測到冠狀病毒抗原，檢測到15份輪狀病毒抗原，陽性率為6.41%，20份微小隱孢子蟲抗原，陽性率為8.54%，7份大腸桿菌F5抗原，陽性率為2.99%；所有糞便樣品均沒有檢測到球蟲，此次調查結果可以為北疆牛場犢牛腹瀉提供臨床治療方案。

以上檢測結果分析顯示：經輪狀病毒感染的犢牛樣品主要采自阿勒泰地區的規模化養殖場及養殖合作社的一個月齡以內的犢牛都有腹瀉癥狀，大腸桿菌、微小隱孢子蟲感染陽性動物臨床癥狀不明顯。為系統性地研究牛場犢牛腹瀉感染情況，后期加大北疆地區牛場樣本量，涵蓋引起犢牛腹瀉的檢測項目如牛病毒性腹瀉等，結合飼養管理因素，更能客觀的反映牛場犢牛腹瀉發生情況，為預防本病發生提供臨床數據。