可視化栓塞微球的制備及研究進展

何逸瑋， 邵國良

血管腔內栓塞是介入治療的重要組成部分，常用的栓塞材料包括固態栓塞劑（明膠海綿、聚乙烯醇顆粒、彈簧圈等）和液態栓塞劑（碘化油、無水乙醇、魚肝油酸鈉等）。 隨著材料學的發展，越來越多的微球類栓塞劑被使用，包括永久性栓塞微球和生物可降解性微球。 栓塞微球表面光滑、不易聚集、粒徑可統一，對特定組織器官的靶向性高，栓塞效果好，尤其載藥微球對惡性腫瘤的治療同時起到栓塞和藥物治療的作用，顯示了較好的效果［1］。 但常用的栓塞微球自身不能在X 射線、CT 或MRI 下顯影，因而難以精準掌控其術中的注射和術后的復查定位。為提高微球栓塞治療的安全性與有效性，且利于術后復查，研制具有可視化功能的微球成為當前的一個熱點，本文就其臨床意義、可視化微球的制備、生物相容性及今后展望作一綜述。

1 可視化微球的臨床意義

常用的介入栓塞微球存在自身無法顯影的缺點，在體內無法跟蹤和定位，因而無法準確判斷微球在血管中的分布情況和栓塞部位，僅能憑借與外源性對比劑（如碘海醇）的混合來輔助微球可視化［2］，但外源性對比劑很快就會隨著血流彌散，從注射部位迅速清除， 術后無法確認栓塞微球的確切位置，從而影響療效評價［3-7］。 賦予栓塞微球具有自身顯影功能，在血管和組織中具有可視性，操作者可以實時監控微球輸注，精準操控，將大大提高手術操作過程的精準性，有效避免異位栓塞的發生，從而提高栓塞治療的療效，減少異位栓塞造成的并發癥。 同時在介入術后的復查中可辨認栓塞微球的位置，有利于評估栓塞區域，指導后續治療［8-9］。 對于載藥微球而言，通過微球的精確定位，可間接指示藥物釋放的靶位。

2 可視化微球的制備

可視化微球按可視的范圍分為三類：X 射線可視微球，MRI 可視微球，多模態（X 射線/MRI）可視微球。 可視微球的制備可通過多種方法實現，常用的主要方法有：物理包埋法、乳化法、電噴霧法、溶劑萃取法、微流控技術等。 物理包埋法是將顯影物質包埋于微球中。 該方法存在顯影物質會從微球中滲出，改變微球的物理化學性質（如疏水性、彈性等），使得微球密度增加，出現微球沉淀等問題［10］。乳化法是將油相物質與水相物質混合形成乳液，其本質是一種液體以極微小液滴均勻地分散在另一種不相容的液體中［11］。 電噴霧（electrospraying，ES）技術是一種可以制備載藥的聚合納米粒子的新型技術［12］，它滿足了納米粒子生產的可擴展性、重現性、有效封裝等潛在需求［13］，能精確控制顆粒大小和分布。 它通過選擇合適的材料，控制顆粒的粒徑，可優化藥物釋放率和藥物靶向治療作用，通過將治療劑包埋在微球內，來降低初始高速釋放率［14］。 溶劑萃取法是通過一種化合物在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度或分配系數的不同，使其從一種溶劑轉移到另一種溶劑中，經過多次萃取，最終提取出絕大部分化合物的方法。 相較于攪拌法等方法，溶劑萃取法能夠有效避免蛋白損傷及微球碰撞粘連等不利因素［15］。 微流控技術是基于微流控芯片，利用微通道對微量流體或樣品（10-9～10-18L）進行操作或控制的技術，其優點為使用樣品、試劑的劑量少以及液滴尺寸、形狀可控［16］。 可視微球的制備，目前主要采用的方法是將不透X 射線的元素和MRI 對比劑引入微球中。 早期主要采用物理包埋法，而近年來隨著微流控技術的興起，其制備的微球，尺寸均一可控，已成為可視微球制備的一種新興的方法。

2.1 X 射線可視微球的制備

物質的密度和厚度決定了其在X 線下的顯影強度。 將不透X 射線的元素引入微球以實現微球在X 線下的可視。不透X 射線的元素包括I，Ag，Ba，Ta等。 Wang 等［17］和Beh 等［18］采用微流控技術和離子交聯法合成了不透射線的、尺寸均勻的BaSO4- 海藻酸鹽微球（KMG）。Zeng 等［19］采用一步靜電噴霧法制備了鉭納米粒子海藻酸鈣微球（Ta@CaAlg）。Kilcup 等［20］用溶劑萃取法合成了由聚乳酸- 羥基乙酸（PLGA）和不透射線多元硅酸鋅玻璃（ORP5）組成的不透射線的復合微球（RC- DEB）。 Ashrafi 等［21］在DC BeadTM基礎上進行了改良，將2，3，5- 三碘苯甲醛偶聯到聚乙烯醇（PVA）水凝膠微球的聚乙烯醇骨架上，制成DC Bead LUMITM。 該方法可使碘均勻地附著在整個微球結構中，在CT 下顯像。 Hagan 等［22］在DC Bead LUMITM基礎上進行研究， 在DC Bead LUMITM中加入一種小分子多酪氨酸激酶抑制劑（MTKi），制備了Vandetanib 載藥微球，為可視載藥微球提供了更多可能。

將合成的微球加入玻璃瓶中或制備成模體，在X射線下觀察顯影效果。 Wang 等［17］將含有不同BaSO4濃度的BaSO4/ALG 微球加入玻璃瓶中， 在CT 下掃描，對微球的X 射線可見度進行評估。 結果顯示微球中BaSO4的含量越高，在X 射線照射下的亮度越強，樣品所測得的CT 值就越大。 Beh 等［18］將制備的X 射線可視微球（XEM）加入瓊脂糖凝膠和稀釋液中，組成模體，在CT 下檢測XEM 的可視度。 結果顯示射線下微球的可見度與XEMs 的濃度呈線性關系。 Ashrafi 等［21］將DC Bead LUMITM制成均勻的瓊脂糖微球模體，在μ-CT 下掃描分析，結果證實了碘均勻分布在微球內部，并且加載阿霉素（Dox） 或伊立替康（Iri）不會影響碘在微球中的分布。

研究者將這些微球植入動物體內，觀察微球在不同時期X 射線下的顯影效果。 Wang 等［17］在DSA的引導下，經微導管將BaSO4/ALG 微球懸液注入兔腎動脈，以市售海藻酸鈣微球（KMG）與市售碘基對比劑（碘二醇溶液）混合為參照物，注入兔腎動脈。在指定的時間間隔內，通過DSA 和CT 成像進一步評估兔腎臟的栓塞效果和兩種藻酸鹽微球的能見度。 結果顯示與KMG 微球相比，BaSO4/ALG 微球栓塞的腎臟輪廓更清晰、完整，對比度更好。 7 d 和14 d后，KMG 微球動物的腎臟輪廓不再清晰可見，而BaSO4/ALG 微球栓塞動物， 仍然可以觀察到由圍繞腎臟的小白點組成的白色環，這可能是由于栓塞后腎臟萎縮和微球的潛在的碎裂所致。 白色環的大小和位置反映了栓塞的范圍和位置。 此研究表明，BaSO4/ALG 微球在X 射線下的良好能見度不僅有利于評價即時的栓塞效果，而且有利于對栓塞部位和療效的隨訪評估。 Beh 等［18］采用健康豬進行了腎動脈和胃底動脈的栓塞術， 以檢測XEM 在體內的可見性和栓塞效果。 結果顯示在實驗操作過程中XEM 直接可視，能清晰觀察到動脈的栓塞，并不需要加入外源性對比劑。 其中在一只實驗動物中可見到XEM 的反流，在術后的病理檢查中得到證實，這充分說明了栓塞過程中微球可視化的重要性。Tacher 等［23］采用VX2 兔肝腫瘤模型，在動脈栓塞術后處死動物，立即采用錐束CT 掃描肝臟。 然后取出肝臟放入裝有10%緩沖甲醛溶液的容器中。 在術后第3 天和第7 天，再次進行錐束CT 掃描，觀察病灶的可見度和對比劑隨時間的洗脫情況。 3 至5 周后，使用高分辨率的顯微CT 評估肝葉內微球的可見性。 結果顯示栓塞微球在所有CT 掃描圖像中都可以觀察到。 Ashrafi 等［21］構建VX2 兔肝內腫瘤模型，進行選擇性肝動脈栓塞術，1 h 后處死動物并CT 掃描。 結果顯示腫瘤周圍動脈血管內有負載阿霉素的DC Bead LUMITM，這是因為在該兔模型中，腫瘤血管相對較細，所以很少有微球進入腫瘤內部，但腫瘤的強化程度低于周圍肝實質的強化程度，表明腫瘤的供血動脈已被成功栓塞。

2.2 MR 可視微球的制備

制備MR 可視微球通常是在微球中加入MR 對比劑，包括順磁性鑭系元素（如鈰、鑭、釹、鐠等）和超順磁性氧化鐵（super paramagnetic iron oxide，SPIO，包括Fe3O4，Fe2O 等）［4，24-25］。Oerlemans 等［25］采用噴射切割技術（JetCutter）制備了藻酸鹽- 鑭系元素微球。Kim 等［26-27］分別在2014年和2015年采用微流控技術制備了包裹了抗癌藥物（6- 甲氧乙基氨基硫化物，MEAN）的超小型超順磁性氧化鐵（USPIO）納米簇藻酸鹽微球和包裹了抗癌藥物（氨化物，AMN）的超小型超順磁性氧化鐵海藻酸鹽微球，兩者均為既可載藥又能MR 可視的栓塞微球。van Elk 等［28］用自制的噴霧裝置制備了溫度敏感脂質體-海藻酸鋇微球（TSL-Ba-MS）和含有鈥離子的海藻酸微球（Ho-MS）。TSL 中含 有阿 霉素（DOX） 和Gd （HPDO3A）（H2O）（T1MRI 對比劑），鈥離子作為T2MRI 對比劑，將兩種微球以95∶5 的比例混合， 以實現微球的可視化。Wang 等［29］采用反相懸浮聚合法制備了空白聚丙烯酸微球， 然后用原位沉淀法負載超順磁性氧化鐵（SPIO）納米粒子，得到MRI 可檢測的SPIO 載藥聚丙烯酸微球（SPMs）。Choi 等［30］采用噴霧凝聚法制備了由海藻酸鈣和USPIO 納米團簇組成的栓塞型微球（ALG-USPIO 微球），該微球可按需降解并在MRI下可視。

Wang 等［29］將一定體積的不同粒徑范圍（100～300，300～500，500～700 和700～900 μm）的微球（SPMs）均勻懸浮在預熱的1%瓊脂糖溶液中，最終濃度分別為0%，2.5%，5%，10%和20%， 分別轉移到Eppendorf 管中，冷卻，使微球懸浮在凝膠中，同時制備不同亞組濃度為20%PM （polyacrylic acid microspheres，聚丙烯酸微球）樣品作為對照，在MR下比較T2 加權成像情況。 結果顯示各亞組SPM 均可清晰檢測到， 而PM 由于與空白凝膠信號強度相近而不能被檢測到。 各亞組SPM 的MR 信號強度隨SPM 濃度的增加而降低。 此外，在相同濃度下，小顆粒SPM 的MR 信號強度比大顆粒SPM 的MR 信號強度要低。 Kim 等［27］將由不同量的AMN- 磁性微球（20 wt%磁團簇）組成的100 μL 溶液添加到有MCARH7777 肝癌細胞的培養基中， 在MR 下比較T2 加權成像情況。 結果顯示在所評估的5 個磁性微球濃度中，T2 加權信號隨微球濃度的增加而呈指數下降。

在動物實驗研究中，大多數研究者均采用小鼠進行實驗，將MR 可視的微球植入小鼠體內，在不同時期采用MR 掃描觀察微球顯影效果。 Wang 等［29］在3 只小鼠背部皮下注射100～300 μm 的SPM 與1%的羧甲基纖維素鈉溶液組成的混懸液0.2 mL，分別于注射后即刻和14 d 進行MRI 隨訪。 結果顯示在T2 加權MR 圖像中，注射SPM 后即刻和14 d，實驗小鼠的皮下組織內可檢測到低信號區。 Kim 等［27］在10 只建模小鼠肝左動脈注入AMN- USPIO- 海藻酸鹽微球（5 mg/200 μL），在動脈注入微球之前和之后收集T2 加權圖像。 結果顯示肝內注射微球僅限于靶向的病灶肝葉，微球沉積的位置表現為點狀低信號，證實了微球栓塞的精準性。

2.3 多模態可視微球的制備

單一模態可視微球不能全面解決術中實時監視、術后多模態顯影的問題。 基于微球內同時聚合不透X 射線物質和MR 對比劑的思路，有學者開始研究X 射線/MRI 均可顯影的多模態可視微球。Stampfl 等［31］采用包埋法制備多模態可視微球。 他們先在Embozene 微球的核心內包埋了不透射線的碘和硫酸鋇，此外，還在微球中包埋了氧化鐵，使其在MR 下可視， 從而制備了改良版Embozene 微球。Oerlemans 等［9］采用乳化、噴射切割技術（JetCutter）制備了由海藻酸鈉（基質形成聚合物）、鈥（交聯和MRI 對比劑）、碘化油（不透射線對比劑）和PluronicF-68（表面活性劑）組成的鈥- 碘油- 海藻酸鹽微球（HO-LIP-AMS）。 Kim 等［32］采用微流控凝膠法制備KMG 微球內載入金納米棒和磁簇的納米復合微球。趙瑋等［33］采用乳化交聯法制備載固態納米Fe3O4顆粒的明膠栓塞微球。 將這些微球制備成模體，分別在X 射線和MR 下觀察其顯影情況。 趙瑋等［33］制備的納米Fe3O4- 明膠栓塞微球，根據微球中Fe3O4與明膠質量比將微球分為3 組（a 組1∶1，b 組2∶1，c 組3∶1），加入去離子水EP 管中，在DSA 及CT 下觀察X 線下顯影效果，檢測顯示，b、c 組微球顯影能力明顯強于a 組。 b、c 組CT 值高于a 組。 取最優化微球， 秤取不同質量微球分別加至90℃1%瓊脂糖溶液中，在MRI 下檢測T2 值，結果顯示T2 值隨微球濃度增高而逐漸下降。Kim 等［32］制備了金納米棒-磁簇- 海藻酸鈉納米復合微球， 用不同濃度的微球在1%瓊脂糖中稀釋制備成像模體，進行MRI 和CT成像。 結果顯示隨著微球濃度的增加，T2 加權信號降低，CT 衰減增加。

Kim 等［32］將制備好的金納米棒- 磁簇- 海藻酸鈉納米復合微球，在原位肝細胞癌大鼠模型上，進行了經導管動脈內灌注，隨后進行了MR 和CT 成像。在T2 加權MRI 圖像中， 腫瘤相對于周圍肝組織表現為高信號，微球沉積的位置表現為腫瘤周邊信號強度的局部降低。CT 成像顯示腫瘤位置周圍的衰減增強。Stechele 等［34］對9 只新西蘭大白兔用SPIO- 聚二氧六環酮（PDO）微球進行單側腎下極動脈的超選擇性栓塞，在介入后1、4、8、12、16 周分別進行DSA檢查和MRI。 結果顯示在每個MR 序列中，即使血管造影顯示完全再灌注， 也能檢測到負載SPIO 的微球的信號改變， 這表明SPIO 浸漬是無創性顯示PDO 微球的有效方法。 T2 序列是檢測SPIO 負載微球的最敏感的MRI 序列。

3 生物相容性

評估微球生物相容性的方法有體外直接接觸法和體內植入法。 體外直接接觸法是將微球與細胞在體外接觸培養，觀察細胞生長情況；體內植入法是將微球植入動物體內合適的部位，觀察機體的反應，并在不同時期取出含植入微球的組織進行檢查及評價［35］。

Wang 等［17］采用體外直接接觸法，用不同濃度的BaSO4/ALG 微球與肝細胞（HepG2 細胞）孵育24 h，采用MTT 法和細胞培養插入法對BaSO4/ALG 微球的細胞毒性進行了評價。 結果顯示微球即使在5 mg/mL的濃度水平下也是相對無毒的，表明該微球有較好的生物相容性。Beh 等［18］采用體內植入法，取出體內可能接受NTE 的栓塞器官和鄰近結構并進行蘇木精- 伊紅和三色染色，檢測XEM 和/或常規栓塞微球是否存在、位置、微球完整性，以及是否存在炎癥。病理學檢查顯示，XEMs 在給藥3 周后仍然完好無損，局部沒有明顯的纖維化或炎性浸潤，具有良好的生物相容性。

可視化栓塞微球相較于普通微球，實現了微球自身在血管中的顯影，可實時監控栓塞操作并直接反饋，避免非靶向栓塞，同時便于栓塞術后復查，大大提高了栓塞治療的有效性與安全性。 而多模態可視微球為術后根據實際情況選擇合適的成像模式示蹤微球的分布及觀察病灶的變化提供更多的選擇。 近年來，隨著載藥微球在栓塞治療肝惡性腫瘤中的廣泛應用，對可視化的研究成為深受關注的問題。 但在可視化載藥微球栓塞治療研究中存在實驗效果與臨床應用不一致的情況，同時如何通過成像分布來預測腫瘤中藥物的劑量或腫瘤不同部位的藥物濃度也有待進一步深入研究［36-37］。 此外，具備表面增強拉曼散射成像的微球可在腫瘤術中起到影像導航的作用［38-40］。 但到目前為止，除個別X 線可視化微球面市外，大多數尚處于實驗室階段，隨著相關研究的進展，相信將有更多的可視化微球進入臨床。