微小RNA調控牙髓干細胞成牙本質向分化的研究進展

胡榮榮 王玉良

【關鍵詞】 牙髓干細胞 微小RNA 成牙本質向分化

[Key words] Dental pulp stem cells microRNA Odontogenic differentiation

First-author’s address： School of Stomatology， Binzhou Medical University， Yantai 264000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.26.045

作為嚴重威脅人們口腔健康的疾病之一，齲病可繼發牙髓炎、根尖周炎，甚至各種頜骨炎癥，最終造成牙體缺損、甚至牙體缺失。與其他組織（如骨組織）相比，受損后具有自我修復和重塑的能力，牙體組織則不容易完全再生且修復程度有限[1]。目前，缺損的牙體組織主要依賴口腔充填材料修復，且無法完全恢復牙齒的生物學性能。所以，牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）在組織再生領域的相關研究受到越來越多患者及科學家的普遍關注。

DPSCs是一類來源于牙髓組織的間充質干細胞（MSCs），可在活髓組織中分離和培養，有較強的增殖、自我更新能力以及分化為多種細胞的潛能，且容易獲得、來源較為豐富、對供體損傷不大、不涉及倫理問題，在組織工程和再生醫學領域的應用十分廣闊[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）作為內源性RNA，大量存在于生物體內，同時，在轉錄后相關基因的調控中具有不可替代作用，參與諸多生物發生過程，如細胞發育、分化、增殖和凋亡等[3]。已有文獻報道，miRNA參與牙齒的發育和再生[4]。

1 DPSCs

人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）是外胚層來源的成體干細胞，源于遷移的神經嵴細胞[5]。2000年，由Gronthos等[6]首次分離、鑒定及命名。在體內和體外適宜培養條件下，DPSCs可分化為成牙本質細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞和神經元細胞[7]，其中牙向分化能力在口腔相關研究中非常重要。成骨誘導可顯著增強DPSCs的礦化能力，同時以HA/TCP為載體與DPSCs結合，可在小鼠體內產生牙本質/牙髓樣復合物[6，8]，以此證明了DPSCs良好的組織再生能力。

2 miRNA

只有1%～2%的RNA分子可翻譯成蛋白質，稱為編碼RNA，大多數是非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）[9]。作為一類重要的ncRNA，miRNA由19～25個核苷酸組成，長度為18～22 nt。最早發現的2個miRNA分別是lin-4和let-7[10-11]，且都存在于線蟲體內。miRNA不僅可以降解mRNA的翻譯，還能抑制mRNA的翻譯，負性調節基因的表達[11]。核酸酶Dicer在miRNA形成過程中發揮重要作用，文獻[12]研究報道，條件性敲除小鼠的Dicer1會導致牙齒原有的大小和形狀發生改變，這表明牙齒的發育受到miRNA的嚴格調控。

3 DPSCs和miRNA

3.1 miRNA在DPSCs成牙本質向分化中的作用 miRNA可在轉錄后水平調節信使RNA（mRNA）向蛋白質翻譯，在所有生物活動中發揮關鍵作用[13]。miRNA具有明顯的特異性，即不僅在不同物種、組織及細胞間會有不同的表達;而且在相同物種、組織及細胞發育的不同時期，其表達也不盡相同[14]。呂紅兵等[15]指出，與非DPSCs對比，DPSCs中表達超過2倍的miRNA有14個，其中有11個上調和3個下調;同時推測，表達譜的差異可能與細胞干性有關。有研究利用PCR對104種已知miRNA分析發現，與BM-MSCs相比，DPSCs中差異表達的miRNA共有48個，其中上調的19個，下調的29個[16]。Gong等[3]使用微陣列分析來篩選和比較hDPCs牙源性分化過程中miRNA譜的變化，發現有22個miRNA差異表達，其中12個上調，10個下調。

miRNA對于DPSCs成牙本質向分化的調控具有雙向作用，它不僅可以促進成牙本質向分化，還可以抑制此過程[9]。研究發現，miR-720在明顯降低其增殖能力的同時，可促進DPC成牙本質向分化;同時指出，miR-720將成為DPC分化過程中的新型miRNA[17]。研究利用miR-210模擬物和抑制物調節DPSCs中miR-210的表達，發現上調miR-210可促進DSPP、DMP1 mRNA及蛋白的表達;抑制其表達，則結果相反。從而提示miR-210在DPSCs成牙本質向分化過程中起正向調節作用，不過，其中作用機制需進一步研究[18]。邱在玲等[19]通過慢病毒轉染hDPSCs過表達miR-146a-5p，結果顯示，過表達組中成牙分化標志物（Dspp、Dmp1）表達顯著上調，由此證明miR-146a-5p正向調控hDPSCs牙向分化。Chang等[4]發現miR-218在DPSCs中表達下調，且miR-218模擬物可顯著降低DPSCs的增殖和分化能力。吳韞慧等[20]發現，miR-431在DPSCs成牙分化過程中表達下調，同時，成牙分化標志物表達顯著上調，推測miR-431負向調控成牙本質向分化。另外，還有較多miRNA正向調節DPSCs牙向分化，如miR-21、miR-223、miR-27a-5p、miR-125a-3p、miR-135b[3，21-24];而miR-143、miR-145、miR-488則可負向調節這一過程[25-26]。

Liu等[25]利用微陣列分析小鼠DPSCs中miRNA的表達，其中，miR-143和miR-145下調最明顯，可與KLF4形成調節反饋環抑制Dspp和Dmp1 mRNA及蛋白的表達，從而負向調控牙向分化。成牙本質向分化過程中，這是首個涉及miRNA的反饋環調控報道。Quaking（QKI）是STAR家族的成員之一，作為RNA結合蛋白直接與RNA結合，存在于各種細胞類型中，影響RNA代謝和信號轉導。隨后的文獻[27]研究中發現，QKI不僅可以作為KLF4的競爭性內源RNA（competent endogenous RNA，ceRNA），通過競爭其共有的miRNA（miR-124-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-429）上調KLF4來促進hDPSCs成牙本質向分化，還可作為DSPP mRNA的結合蛋白來促進hDPSCs的成牙本質向分化。

每個miRNA可以靶向調控多個mRNA;同時，每個mRNA也可以由多個miRNA靶向調控。一方面，miRNA在轉錄后水平抑制或降解mRNA翻譯;另一方面，miRNA似乎還具有后續作用，可能通過相應反調節機制發揮其他mRNA水平及蛋白質相互作用[16]。

3.2 miRNA調控DPSCs成牙本質向分化中相關的信號通路 DPSCs成牙本質向分化過程中受多種因素（如miRNA、信號通路等）調控。包括細胞分化在內的諸多生物發生過程都離不開miRNA的參與。已有研究證明，miRNA通過相關信號途徑在DPSCs成牙本質向分化中發揮重要作用。

3.2.1 Notch信號通路 邱在玲等[28]發現，上調miR-146a-5p表達后，DPSCs增殖能力下降，然而可顯著促進DPSCs分化;反之，則結果相反。利用siRNA-Notch1轉染DPSCs來干擾Notch信號，可促進DPSCs分化而抑制其增殖，Notch1作為miR-146a-5p的直接靶點，由此證明，miR-146a-5p可通過Notch1參與調控Notch信號通路，在促進DPSCs分化中發揮重要作用。

3.2.2 NF-κB信號通路 Wang等[23]指出miR-125a-3p可能與齲齒的嚴重程度呈負相關，在齲齒中，侵入髓腔的病原體通過釋放各種炎癥因子導致DPSCs中miR-125a-3p表達增加，致使Fyn上調。Fyn與NRP1相互作用形成NRP1-Fyn復合物來激活NF-κB信號通路。結果顯示，DPSCs的成牙本質向分化能力降低，炎癥反應進一步擴大，最終破壞了正常的牙齒組織致使齲齒更加嚴重。

3.2.3 MAPK信號通路 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）可識別各種胞外部信號，并被激活，在信號向細胞內傳導過程中具有重要作用[29]。MAPK可分為4個亞族：ERK、p38、JNK和ERK5。有文獻證明，生長因子，細胞因子和機械刺激通常通過激活MAPK（特別是通過ERK1/2途徑）誘導細胞分化和礦化變化。

研究發現miR-135b的潛在靶基因有APC、MEF2C和COL5A1，于是推測表達下調的miR-135b通過它們來調控MAPK和Wnt信號通路，從而促進hDPCs牙源性分化[3]。Chang等[4]指出miR-218通過ERK1/2途徑負向調節DPSCs牙本質生成。研究證明，過度表達的miR-143-5p可以通過降低p38 MAPK通路相關基因（MAPK14、Ras和MKK3/6）和成牙本質向分化標志物（ALP、DSPP、OCN）的表達來負向調控這一過程[30];同時，文獻[26]報道稱，miR-488的下調可通過MAPK1激活p38 MAPK信號通路，同時增加DSPP、ALP和OCN的表達，從而證明miR-488在hDPSCs成牙本質向分化過程中起負向調控作用。另外，也可利用OPG/RANKL信號通路調控Runx2表達來負向調控這一過程[31]。

除以上幾種信號通路，此外與DPSCs成牙本質向分化相關的信號通路還有Wnt、TGF-β1/smads、LPS/TLR-4、OPG/RANKL等信號通路[3，21，32-33]。miRNA與這些信號通路及其他相關因子形成復雜網絡來調控DPSCs成牙本質向分化。

4 小結與展望

目前，miRNA調控DPSCs成牙本質向分化的具體機制尚不清楚，其中涉及復雜的調控網絡。DPSCs成牙本質向分化過程中涉及較多的信號通路，目前有關MAPK途徑的報道較多;已發現較多數量的特定miRNA，還有更多miRNA等待發現;它們對牙向分化具有雙向作用;現相關研究僅處于分子水平，接下來還需可靠的臨床前動物體內實驗。因此，人們還需不斷研究和探索，為實現牙本質再生及牙再生提供理論基礎。

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（收稿日期：2020-12-02） （本文編輯：張爽）