建佛手總黃酮的超聲波提取工藝優(yōu)化及抗氧化分析

黃 靖，陳 嬋，黃曉梅

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州350007）

0 引言

佛手為蕓香料柑桔屬植物，是傳統(tǒng)的名貴中藥，也是首批藥食同源植物[1]。佛手全身都是寶，其藥性溫，味辛、苦、酸，歸肝、脾、肺經(jīng)。現(xiàn)代研究表明，佛手富含黃酮、多糖、揮發(fā)油、檸檬油素和香豆素等多種活性成分[2-5]。黃酮類化合物作為佛手的主要藥效成分，有解痙、降血糖、降血脂、抗菌消炎、抗氧化等多種藥理活性[6-8]。

佛手在中國長江以南各地均有栽種，按照產(chǎn)地可分為廣佛手、川佛手、金佛手和建佛手[9]。佛手總黃酮的提取研究涉及廣東、廣西的廣佛手、浙江的金佛手以及四川的川佛手的較多[10-15]。鄧祥等[10-11]研究了川佛手中黃酮類物質(zhì)的微波和超聲波聯(lián)合提取工藝及超臨界CO2流體萃取技術(shù)，在最佳提取工藝條件下，川佛手總黃酮的提取率分別約為44.05 mg/g和3.79%。章斌等[12-13]研究了復(fù)合酶法和超聲提取廣佛手總黃酮的工藝，佛手總黃酮得率分別為4.093%和3.22%。王晉等[14]進(jìn)行了廣佛手中黃酮提取工藝的優(yōu)化，黃酮得率為1.34%。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地、不同的提取方法對佛手黃酮提取影響較大[15-17]。目前，有關(guān)建佛手中黃酮提取研究較少。

超聲波設(shè)備已經(jīng)運(yùn)用得越來越廣泛，超聲波產(chǎn)生的空化作用和機(jī)械作用等能有效提高細(xì)胞破碎效率，有利于有效成分的析出，操作簡單，且對設(shè)備要求不高，提取率高，反應(yīng)過程無物料損失，回收率相對較高[18]。筆者采用超聲波提取技術(shù)，以建佛手為原料，研究超聲波提取法提取總黃酮的最優(yōu)工藝，并對提取得到的佛手總黃酮進(jìn)行抗氧化研究，以期為福建本地佛手資源的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佛手是由福建省賢芳佛手農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供的建佛手[19]。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（Aladdin Chemistry Co.Ltd.，蕓香葉苷，分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%）。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、石油醚等所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PB 80 Easy 218美的破壁機(jī)（廣東美的生活電器制造有限公司），101-2型鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司），RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），KQ-300VDV三頻數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司），722S可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取建佛手總黃酮

工藝流程：清洗→切片→烘干→粉碎→過篩→脫脂、脫色→浸泡佛手粉→超聲提取→抽濾→定容→測定吸光值。

操作要點(diǎn)：（1）原料預(yù)處理。福建佛手清洗切片后，50℃干燥至恒重，粉碎成一定粒度，過40目篩，備用。（2）脫脂。用石油醚浸泡一定時(shí)間去色，重復(fù)3次，余下的固體粉末自然揮發(fā)干，備用[20]。（3）超聲提取。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在其他條件固定的情況下，采用超聲頻率為45 kHz/80 kHz雙頻模式時(shí)，即每隔30 s轉(zhuǎn)換一次的超聲條件下，佛手總黃酮的提取率最高，因此均采用雙頻模式，以一定量佛手干粉按照料液比用一定濃度的乙醇溶液先浸泡30 min后，分別用不同的超聲功率提取不同時(shí)間。（4）樣品測定。超聲提取結(jié)束后，抽濾，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇。濾液用相同濃度的乙醇溶液定容至100 mL，稀釋至一定濃度，測定樣品液中總黃酮含量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品測定計(jì)算 準(zhǔn)確配制濃度為1.0 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL蘆丁溶液于10 mL具塞刻度試管中，先加0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻并放置6 min后，加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻后放置6min，最后加入4.0mL NaOH(1 mol/mL)溶液，用60%乙醇定容至10 mL，搖勻，放置15 min后于510 nm下測定吸光度x，得到蘆丁質(zhì)量濃度y(mg/mL)與吸光度x之間的線形回歸方程[13]。在0～0.12 mg/mL的線性范圍內(nèi)，線性方程為y=1.1243x+0.0045，R2=0.9998。

樣品測定：將提取的樣品液稀釋至一定濃度，吸取1.0 mL按上述步驟操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出提取液中總黃酮的含量，并以此計(jì)算各處理的總黃酮提取率[式(1)]。

式中，C為提取液中的總黃酮濃度，V為提取液的體積，M為建佛手的質(zhì)量。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[10-14]，單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以建佛手干粉為試樣，總黃酮得率為考察指標(biāo)，分別考察料液比、乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、超聲溫度以及超聲功率5個(gè)因素對佛手總黃酮得率的影響。采用45 kHz/80 kHz雙頻模式，固定超聲功率50W，提取溫度50℃，提取時(shí)間60 min，乙醇濃度60%，料液比1:15、1:20、1:25、1:30、1:35；固定料液比 1:30，提取溫度50℃，超聲功率50 W，提取時(shí)間60 min，乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%；固定超聲時(shí)間60 min，料液比1:30，乙醇濃度60%，提取溫度50℃，超聲功率50、60、70、80 W；固定料液比1:30，超聲功率50 W，提取溫度50℃，乙醇濃度60%，浸提時(shí)間40、60、80、100、120 min；固定料液比1:30，超聲功率50 W，乙醇濃度60%，浸提時(shí)間 60 min，浸提溫度為 40、50、60、70、80℃。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果選定4因素3水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定超聲波提取的最佳工藝參數(shù)。

1.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及精密度實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5份佛手試樣，以正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，分別按照1.3.2中的方法進(jìn)行總黃酮含量的測定[21]。

以正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，然后分別準(zhǔn)確量取2.00 mL待測液于5個(gè)10 mL比色管中，分別按照1.3.2的方法進(jìn)行總黃酮含量的測定。

1.3.5 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確移取已知總黃酮質(zhì)量濃度的建佛手溶液0.5 mL，平行5份，分別置于25 mL比色管中，再分別準(zhǔn)確加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 mg/mL)。按1.3.2方法測定總黃酮質(zhì)量濃度[22]。

1.3.6 建佛手總黃酮的抗氧化研究 比較同濃度下建佛手總黃酮與Vc對羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力。采用Fenton反應(yīng)法測定佛手總黃酮清除·OH能力[23-24]，采用鄰苯三酚自氧化法測定佛手總黃酮清除O2-·能力[25-26]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 單因素及正交實(shí)驗(yàn)均平行3次，應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對建佛手總黃酮提取率的影響

圖1結(jié)果顯示，料液比影響建佛手總黃酮的提取率。在料液比為1:15～1:30范圍內(nèi)，佛手總黃酮得率呈上升趨勢，當(dāng)料液比為1:30時(shí)，建佛手總黃酮的提取率最高，達(dá)到2.22%。

圖1 料液比對建佛手總黃酮提取率的影響

2.2 乙醇濃度對建佛手總黃酮提取率的影響

圖2結(jié)果表明，乙醇濃度在40%～60%范圍內(nèi)，佛手總黃酮與乙醇濃度呈正相關(guān)。乙醇濃度為60%時(shí)，提取率最高，達(dá)到2.32%，隨著乙醇濃度的提高，提取率反而下降。

圖2 乙醇濃度對佛手總黃酮提取率的影響

2.3 超聲功率對建佛手總黃酮提取率的影響

圖3結(jié)果表明，超聲功率對建佛手總黃酮的提取率有影響，超聲功率為50 W時(shí)，建佛手總黃酮的提取率最高，為2.81%。當(dāng)超聲功率超過50 W范圍，超聲功率越高，總黃酮的提取反而下降。

圖3 超聲功率對佛手總黃酮提取率的影響

2.4 超聲提取時(shí)間對建佛手總黃酮提取率的影響

圖4結(jié)果表明，在雙頻率、超聲功率50 W、提取溫度50℃、料液比1:30的提取條件下，超聲時(shí)間在60 min時(shí)，建佛手總黃酮的提取率最高，隨之下降。原因可能在于當(dāng)超聲時(shí)間過長易造成總黃酮的降解，而使提取率下降。

圖4 超聲時(shí)間對佛手總黃酮提取率的影響

2.5 提取溫度對建佛手總黃酮提取率的影響

在超聲過程中，無論采用哪種頻率模式，都會(huì)造成溫度的小幅波動(dòng)。在雙頻模式下，溫度的波動(dòng)幅度在1～3℃。圖5結(jié)果表明，當(dāng)溫度超過50℃時(shí)，超聲提取溫度越高，總黃酮的提取率反而下降，在其他因素確定的條件下，溫度對總黃酮提取率的影響不太顯著，故提取溫度不作為正交實(shí)驗(yàn)考慮因素。

圖5 超聲溫度對佛手總黃酮提取率的影響

2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出因素水平（表1）。以建佛手干粉為試樣，以總黃酮提取率為考察對象，選擇料液比、乙醇濃度、超聲功率、超聲提取時(shí)間4種因素，進(jìn)行L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，研究超聲波提取佛手總黃酮的最佳提取條件。結(jié)果分析見表2～3。

表1 因素水平表

表2 建佛手總黃酮超聲波提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在影響建佛手總黃酮的超聲波提取工藝中，影響因素為C（超聲功率）＞D（提取時(shí)間）＞B（乙醇濃度）＞A（料液比）。超聲功率對佛手總黃酮的提取率影響極顯著(P＜0.01)，超聲時(shí)間與乙醇濃度的影響顯著(P＜0.05)，料液比影響無顯著性。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，超聲波提取建佛手總黃酮最佳提取工藝條件為A3B2C1D3，即料液比1:35、乙醇濃度60%、超聲功率50 W、提取溫度50℃條件下提取80 min，建佛手總黃酮的提取率最高。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及精密度

按照正交實(shí)驗(yàn)選定的A3B2C1D3進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，得到此條件下的提取率為3.33%，RSD值為0.62%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。表明超聲波輔助提取建佛手總黃酮工藝可靠，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小，工藝穩(wěn)定可行。

2.8 加標(biāo)回收率

根據(jù)1.3.5的方法，測定加標(biāo)回收率，平均回收率為96.34%，RSD=0.83%(n=5)，說明該方法準(zhǔn)確度高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，此工藝條件下提取建佛手總黃酮是可行的。

2.9 建佛手總黃酮抗氧化活性分析

配制0.2～1.4 mg/mL質(zhì)量濃度的建佛手總黃酮提取液，以相同濃度的Vc溶液為對照組。用Fenton反應(yīng)法及鄰苯三酚自氧化法測定2種溶液對·OH及對O2-·的清除作用，結(jié)果見圖6～7。結(jié)果顯示，建佛手總黃酮溶液具有抗氧化活性，濃度0.2～1.4 mg/mL清除能力與濃度呈正比，然而對·OH及對O2-·的清除作用均不如同濃度的Vc溶液。當(dāng)建佛手總黃酮質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時(shí)，佛手總黃酮對·OH和O2-·的清除率分別為54.4%和39.2%。

圖6 建佛手總黃酮與Vc對O2-·的清除能力

圖7 建佛手總黃酮與Vc對·OH的清除能力

3 結(jié)論

本研究通過超聲波提取技術(shù)，獲得建佛手總黃酮的最優(yōu)提取工藝，即超聲頻率為45 kHz與80 kHz雙頻模式下，料液比1:35，乙醇濃度60%，超聲功率50 W，提取溫度50℃，提取80 min，建佛手總黃酮的提取率最高，可達(dá)3.33%。與其他產(chǎn)地的佛手總黃酮含量相比，建佛手總黃酮含量低于川佛手，高于廣佛手[10-15]。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明，建佛手總黃酮溶液具有抗氧化活性，濃度0.2～1.4 mg/mL其清除能力與濃度呈正比，然而對·OH及對O2-·的清除作用均不如同濃度的Vc溶液。當(dāng)建佛手總黃酮質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時(shí)，佛手總黃酮對·OH和O2-·的清除率分別為54.4%和39.2%。

4 討論

在同樣采用超聲波輔助提取總黃酮的技術(shù)中，本研究結(jié)果與其他產(chǎn)地的佛手總黃酮提取率較接近，然而提取時(shí)間縮短，原因可能在于采用了雙頻模式。在超聲波輔助提取工藝中，不同頻率的超聲波對總黃酮的提取率有影響，超聲頻率是決定超聲作用的重要因素，高頻超聲不易發(fā)生空穴作用，且方向性強(qiáng)，散射強(qiáng)，超聲頻率對超聲浸取效果的影響復(fù)雜[27]，故多數(shù)提取工藝固定某種頻率[28-29]，本研究實(shí)驗(yàn)表明，采用雙頻模式，有利于提高總黃酮提取率，并縮短提取時(shí)間，超聲頻率及超聲功率對佛手總黃酮提取的影響及動(dòng)力學(xué)模型可進(jìn)一步研究。建佛手體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)為開發(fā)新型的佛手黃酮保健品提供了理論依據(jù)。