抗獼猴桃細菌性潰瘍病蠟樣芽孢桿菌MA23培養基及發酵條件優化

朱海云，馬 瑜，柯 楊，李 勃

（陜西省微生物研究所，西安710043）

0 引言

隨著人口的不斷增長及可利用土地資源的持續減少，人類對食品的需求日益增加，而農作物病害的不斷發生嚴重威脅著全球食品安全[1]。多年來，化學藥劑因高效、低成本等特點成為防治農作物病害的主要藥劑，但隨之而來的一系列負面效應，如環境污染、農產品農藥殘留超標以及病原菌抗藥性等問題，已經引起全社會的廣泛關注。因此，尋找新的綠色、無公害防治藥劑成為提升農產品品質的關鍵。其中，利用微生物及其代謝產物進行生物防治，被公認為是一種環境友好型的選擇。

微生物類生防菌在防治多種植物病害的同時可促進植物生長，且有助于改善種植環境，從而獲得長期效益。目前，已有許多生防菌被商業化生產，如芽孢桿菌、假單胞菌等[2]。蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一類能產生抗逆性芽孢的革蘭氏陽性好氧菌，它對營養要求簡單，抗逆性強，繁殖速度快，能適應各種環境，廣泛存在于自然界中[3]。蠟樣芽孢桿菌能夠產生抗生素、細菌素、抗菌肽等多種具有抑菌活性的物質[4-6]，可有效抑制多種植物病原菌，如番茄腐爛病病原菌(Pythium aphanidermatum)、番茄青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)、玉米穗腐病病原菌(Fusarium verticillioides)、小麥紋枯病病原菌(Rhizoctonia cerealis)、Pseudomonassyringae和Agrobacteriumtumefaciens等[7-11]。Goutam Banerjee等將蠟樣芽孢桿菌IB311應用于花生和芝麻田間實驗，證明其可以有效提高作物產量[12-13]。

目前，已有大量蠟樣芽孢桿菌抑制植物病原菌的報道，而將其應用于實際生產的報道還較為少見[14]。生防菌能否走向實際應用受到多種因素的影響，而發酵是首要的影響環節。提高發酵液的菌體量及抑菌活性將為進一步開展實際應用奠定基礎。菌體量及抑菌活性的提高是保證其定殖能力、穩定性以及防治效果的關鍵[15-16]，而培養基配方對菌體量及抑菌活性具有顯著的影響，因此，優化培養基是實驗室和工業發酵中提高菌體量及抑菌活性的一個重要步驟[17]。此外，發酵條件對于發酵液中的菌體量以及代謝產物活性也至關重要。因此，優化發酵培養基及發酵條件可以有效提高發酵液的菌體量和抑菌活性[18-19]。

獼猴桃潰瘍病是一種由革蘭氏陰性菌丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa)引起的嚴重病害，該病于20世紀80年代在日本首次發病，之后迅速席卷世界各大獼猴桃產區[20]。獼猴桃潰瘍病主要危害樹干、枝條，嚴重時造成植株、枝干枯死，同時危害葉片和花蕾，導致果皮變厚，果實畸形，產量降低[21]。獼猴桃潰瘍病傳染性強，根除難度大，目前還沒有有效的防治藥劑。傳統的防治藥劑主要是銅制劑和農用鏈霉素。由于病原菌變異性強，極易產生抗藥性，已經出現對銅制劑和農用鏈霉素的抗藥性菌株[22-24]。因此，應用安全、可靠、無殘留、對環境友好的生防菌進行獼猴桃潰瘍病的防治已經成為研究熱點。本研究在前期分離得到一株對Psa抑制效果顯著的蠟樣芽孢桿菌MA23的基礎上，應用正交設計實驗和單因素實驗對蠟樣芽孢桿菌MA23的搖瓶發酵培養基及發酵條件進行優化，以期為該菌株的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養基

實驗于2019年8月至2020年1月在陜西省微生物研究所微生物技術研究中心實驗室內開展。蠟樣芽孢桿菌MA23從秦嶺野生銀杏樹組織中分離獲得，保藏于陜西省微生物研究所菌種保藏中心(SMRL)。獼猴桃潰瘍病病原菌丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringaepv.actinidiae)由本課題組分離并保藏于陜西省微生物研究所菌種保藏中心(SMRL)。

PSA培養基：蛋白胨0.5%，蔗糖2%，K2HPO40.05%，MgSO4?7H2O 0.025%，瓊脂15%，余量為水，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

LB培養基（種子培養基）：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉0.5%，pH 7.0，固體培養基加1.5%瓊脂粉，余量為水，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

初始發酵培養基[25]：葡萄糖2.5%，蛋白胨0.05%，可溶性淀粉4%，NaNO30.3%，MgSO40.15%，K2HPO40.25%，CaCO30.12%，MnSO40.035%，余量為水，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 菌體培養

1.2.1 菌種活化 將-80℃保存的菌種劃線接入LB斜面，30℃靜置培養48 h，挑取單菌落接種于斜面于30℃靜置培養24 h。

1.2.2 種子液制備 取一環活化后的斜面菌種到裝有50 mL液體LB培養基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min恒溫震蕩培養16 h。

1.2.3 初始及正交發酵培養 以5%的接種量將種子液接種于裝有70 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min培養48 h。

1.3 發酵液活菌數測定

采用平板菌落計數法檢測發酵液中的活菌數[26]。

1.4 培養基優化及發酵條件優化

以葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、可溶性淀粉(C)、NaNO3(D)、K2HPO4(E)和 MgSO4(F)為考察因素，以發酵液中的活菌數為菌體量指標，運用SPSS 20軟件設計混合正交實驗，其中葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉和NaNO3各安排4個水平，K2HPO4和MgSO4各安排2個水平。所有實驗重復3次，分別平行取樣。

以正交優化后的最優培養基作為基礎發酵培養基，通過單因素實驗依次對發酵條件（初始pH、培養溫度、接種量、裝液量及轉速）進行優化，分析其對菌體量的影響，確定最佳發酵條件。

1.5 發酵液抑菌活性測定

以Psa作為指標菌，采用管碟法[27]測定菌株MA23發酵液的抑菌活性。取100 mL PSA培養基融化后冷卻至50℃，向其中加入1 mL濃度為108CFU/mL的Psa菌懸液，混勻，倒平板；同時，以無菌水為對照。每個平板上均勻放置3個牛津杯，每個牛津杯加入200 μL發酵液，28℃下培養48 h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，每個實驗做3次平行，取平均值。

1.6 數據分析

應用Excel 2007進行各因素各水平的K值計算及發酵條件優化數據的處理和作圖。應用SPSS 20進行正交實驗方差分析[28-29]。

2 結果與分析

2.1 正交實驗結果及方差分析

正交實驗結果及Kij值如表1所示，方差分析結果如表2所示。由方差分析結果可知，因素B、C、E和F高度顯著，因素D顯著，因素A不顯著，各因素對實驗結果的影響由強到弱表現為C＞E＞B＞F＞D＞A。通過比較各因素不同水平的K值確定優水平，因素B、C、D、E和F分別選B4、C4、D1、E2和F2，因素A的水平改變對實驗結果影響不顯著，從經濟角度考慮選A1，因此最優組合為A1B4C4D1E2F2，即MA23的最優發酵培養基為葡萄糖0.8%，蛋白胨0.2%，可溶性淀粉3.5%，NaNO30.05% ，K2HPO40.2% ，MgSO40.2% ，CaCO30.12%，MnSO40.035%。保持發酵條件不變，采用最優發酵培養基進行驗證發酵，優化培養基發酵液中的菌體量為1.96×109CFU/mL，較初始發酵培養基菌體量(1.39×109CFU/mL)提高了41%。

表1 正交實驗設計及結果

續表1

表2 正交實驗方差分析

2.2 發酵條件優化

2.2.1 培養基初始pH對菌體量的影響 調節培養基初始pH，以5%的接種量和70 mL的裝液量在30℃下180 r/min發酵48 h，不同初始pH發酵液中的活菌數如圖1所示。發酵液中的活菌數隨pH的升高先增加后降低；當初始pH 6.5時，發酵液中的活菌數最高，為2.26×109CFU/mL，顯著高于其他初始pH發酵液中的活菌數，分別比相鄰2個初始pH 6.3和pH 6.8發酵液中的活菌數高6.3%和3.8%。

圖1 初始pH對菌體量的影響

2.2.2 發酵溫度對菌體量的影響 培養基初始pH 6.5，以5%的接種量和70 mL的裝液量在不同溫度下180 r/min發酵48 h，不同溫度下發酵液中的活菌數如圖2所示。隨著發酵溫度的升高，發酵液中的活菌數呈現先增加后降低的趨勢；當發酵溫度為30℃時，發酵液中的活菌數最高，為2.27×109CFU/mL，顯著高于其他發酵溫度下發酵液中的活菌數，且分別比2個相鄰發酵溫度28℃和33℃發酵液中的活菌數高出11.3%和12.1%。

圖2 發酵溫度對菌體量的影響

2.2.3 接種量對菌體量的影響 培養基初始pH 6.5，以不同的接種量和70 mL的裝液量在30℃下180 r/min發酵48 h，不同接種量發酵液中的活菌數如圖3所示。發酵液中的活菌數隨接種量的增加呈現先升高后降低的趨勢；當接種量為8%時，發酵液中的活菌數最高，為2.48×109CFU/mL，與接種量為10%的發酵液中的活菌數相比無顯著性差異，但是顯著高于其他接種量的發酵液中的活菌數，比接種量為12%和5%的發酵液中的活菌數分別高出8.8%和10.5%。

圖3 接種量對菌體量的影響

2.2.4 搖瓶裝液量對菌體量的影響 培養基初始pH 6.5，以8%的接種量和不同的裝液量在30℃下180 r/min發酵48 h，不同裝液量發酵液中的活菌數如圖4所示。發酵液中的活菌數隨裝液量的增加先升高后降低；裝液量為70 mL時，發酵液中的活菌數最高，為2.50×109CFU/mL，明顯高于其他裝液量，比裝液量為50 mL和80 mL發酵液中的活菌數分別高8.4%和8.1%。

圖4 裝液量對菌體量的影響

2.2.5 搖床轉速對菌體量的影響 培養基初始pH 6.5，以8%的接種量和70 mL的裝液量在30℃下以不同的轉速發酵48 h，不同轉速發酵液中的活菌數如圖5所示。隨著搖床轉速的增大，活菌數量先增加后降低，且當轉速為180 r/min時，發酵液中活菌數最高，達到2.51×109CFU/mL，顯著高于其他轉速下發酵液中的活菌數，比相鄰2個轉速160、200 r/min發酵液中的活菌數分別高18.9%和7.2%。

圖5 搖床轉速對菌體量的影響

2.3 抑菌活性測定

以Psa為指示菌，研究培養基及發酵條件優化對蠟樣芽孢桿菌MA23發酵液抑菌活性的影響（如表3所示）。結果表明，經過正交優化后，發酵液的菌體量和抑菌活性都有較大幅度的提高，較正交優化前分別提高了41.0%和37.2%。利用優化培養基進行發酵條件優化后，發酵液的菌體量和抑菌活性得到了進一步的提高，分別提高了28.2%和25.6%（圖6）。

圖6 優化前后對Psa抑菌效果對比

表3 優化前后菌體量及抑菌圈大小比較

3 結論

本研究通過正交優化實驗和單因素實驗分別對蠟樣芽孢桿菌MA23的發酵培養基和發酵條件進行優化，確定最優發酵培養基為葡萄糖0.8%，蛋白胨0.2%，可溶性淀粉3.5%，NaNO30.05%，K2HPO40.2%，MgSO40.2%，CaCO30.12%，MnSO40.035%，最佳發酵條件為初始pH 6.5，發酵溫度30℃，接種量8%，容積250 mL搖瓶的裝液量為70 mL，搖床轉速180 r/min。經過優化，蠟樣芽孢桿菌MA23的菌體量和抑菌活性均得到大幅度的提高，為其發酵條件逐級放大及下游產物的開發提供參考，將有效推動其在獼猴桃潰瘍病田間防治中的應用。

4 討論

研究表明，蠟樣芽孢桿菌可以有效抑制革蘭氏陽性菌、絲狀真菌和酵母菌，但其對革蘭氏陰性菌的抑制作用卻鮮有報道[30-31]。本研究的前期研究結果表明，蠟樣芽孢桿菌MA23對革蘭氏陰性菌Psa具有顯著的抑制作用。因此，優化蠟樣芽孢桿菌MA23發酵培養基及發酵條件，提高其菌體量和抑菌活性，將為其進一步應用奠定基礎。

采用方差分析正交實驗結果可以分析出實驗誤差的大小，從而知道實驗精度；不僅可給出各因素對實驗指標影響的主次順序，還可分析各因素影響的顯著性。蠟樣芽孢桿菌MA23培養基正交實驗方差分析結果顯示，各因素對實驗結果影響由主到次的順序為可溶性淀粉＞K2HPO4＞蛋白胨＞MgSO4＞NaNO3＞葡萄糖，而且蛋白胨、可溶性淀粉、K2HPO4和MgSO4為高度顯著因素，NaNO3為顯著因素，葡萄糖為不顯著因素。對于顯著因素，選取優水平并在實驗中加以嚴格控制；對不顯著因素，可視具體情況確定優水平。因此從經濟角度考慮，將葡萄糖的優水平確定為0.8%，其他因素參考各水平的K值，最終確定最優培養基為A1B4C4D1E2F2，即葡萄糖0.8%，蛋白胨0.2%，可溶性淀粉3.5%，NaNO30.05%，K2HPO40.2%，MgSO40.2%。作為速效碳源的葡萄糖對發酵液中活菌數的影響沒有顯著性，而作為遲效碳源的可溶性淀粉對發酵液中活菌數的影響高度顯著，而且，當可溶性淀粉為最高水平時，發酵液中的活菌數最高，說明0.8%的葡萄糖已經滿足蠟樣芽孢桿菌MA23對速效碳源的需求，在整個發酵過程中，蠟樣芽孢桿菌MA23更多地利用可溶性淀粉這一遲效碳源。

微生物的發酵機理復雜，且受多種因素的影響，除發酵培養基組成外，發酵條件（pH、溫度、接種量、裝液量和轉速等）也是影響微生物發酵產物生成量的關鍵因素[32]。其中，培養基pH可以影響菌體細胞膜帶電荷的狀態、細胞膜的通透性及培養基組分的解離，從而影響菌體對營養物質的吸收及其生長；溫度主要通過改變酶反應速率、細胞膜的流動性及物質的溶解度影響菌體的生長，且不同微生物的最適生長溫度不同；而接種量與微生物生長繁殖密切相關，適當的接種量有利于微生物的生長繁殖；裝液量直接影響菌體和空氣的接觸，進而影響培養基中的溶氧和菌體的生長繁殖；搖床轉速直接影響培養基中的通氣量，從而影響菌體生長。本研究通過搖瓶發酵條件優化得到蠟樣芽孢桿菌MA23的最佳發酵條件為培養基初始pH 6.5，發酵溫度30℃，接種量為8%，裝液量為70 mL，搖床轉速為180 r/min。在優化后的條件下，菌株MA23發酵液中的最高活菌數可達到2.51×109CFU/mL。經過培養基及發酵條件的優化，菌株MA23的菌體量和抑菌活性都得到大幅提高。其中，培養基優化后，菌株MA23發酵液的菌體量和抑菌活性分別提高了41%和37.2%。經過進一步發酵條件優化后，菌株MA23發酵液的菌體量和抑菌活性分別提高了28.2%和25.6%。

蠟樣芽孢桿菌MA23對Psa具有較好的抑制效果，經過培養基及發酵條件優化，其抑菌活性得到了大幅提高。但是，發酵培養基及發酵條件的優化不是一蹴而就的，隨著發酵培養的進一步放大，需要結合多種方法進行多次優化，以進一步獲得更優的結果。因此，今后應在正交優化的基礎上，結合多種優化方法，進一步優化其放大培養的發酵培養基和發酵條件，提高其抑菌活性，降低生產成本。