蘋果炭疽病抗性miRNA的篩選

張亞楠，陳新慧，張 杰

（農業應用新技術北京市重點實驗室/植物生產國家級實驗教學示范中心/北京農學院植物科學技術學院，北京102206）

0 引言

蘋果炭疽病是蘋果生產中的主要病害之一，其主要致病菌為蘋果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)，以危害蘋果葉片和果實為主，目前針對該病的防控措施主要為施用化學藥劑，生產上多以波爾多液和多菌靈交替使用進行病害防治，具有一定預防效果，但需要噴施3～4次，不僅加重果園管理的工作量，也增加了生產成本，且頻繁施用藥劑不僅使種植環境惡化，更給食品安全帶來極大的隱患[1]。蘋果炭疽病因發病迅速、潛育期短的特征使蘋果生產者頭痛不已，病原菌一旦侵入寄主組織，幾乎沒有用藥防治的時間，常帶來減產甚至絕產的危害。目前，利用植物誘導抗病機制控制病害，能減輕生態環境污染，具有持效期長、抗病譜廣等優點，是一種植物病害防治的新策略。

miRNA是一類內源的調節基因表達的小RNA，長度19～25個核苷酸(nt)，對靶基因mRNA的作用主要取決于它與靶基因轉錄體序列互補的程度，主要有3種方式，第一種是通過堿基互補切割靶基因，第二種抑制靶基因的翻譯但不完全互補結合，而是阻遏翻譯但不影響mRNA穩定性，第三種為結合抑制，miRNA通過這些方式在真核基因表達調控中廣泛存在并具有多樣性[2]。miRNA能否正常表達，決定了植物是否正常生長發育，已有研究表明，miRNA廣泛參與調節植物生長、器官建成和形態發育，轉錄因子的表達情況是其主要調控途徑[3]。植物并非總是在正常適宜的環境中，在其整個生命周期中，會面臨各種各樣的變化，地理因素、氣候條件，尤其是人類活動和工農業發展也造成了諸多環境問題和污染，而這些因素的變化超出了植物維持正常生命所能自動調節的范圍，使其生長受限、病變甚至死亡。植物所遭受的脅迫通常為生物逆境（病毒、蟲害、雜草等）和理化因素逆境（極端天氣氣候、離子輻射、化學性鹽堿土危害、大氣、水體、土壤污染、高溫熱害、低溫冷害和凍害、淹澇災害和干旱等）。逆境脅迫會誘使植物內的基因表達發生改變，從而引起形態結構變化和某些代謝變化，如水分代謝、光合作用、呼吸作用和物質代謝。而植物的生理適應是多方向的，主要包括滲透調節、植物激素和蛋白質的適應性變化。在脅迫條件下miRNA同樣可以調控植物的生長發育，從而增強植物自身對逆境脅迫的適應能力，分為避逆性和抗逆性[4]。miRNA可以在相對較短的時間內對植物所遭受的外界脅迫做出快速響應，通常24 h內即有較明顯變化，相應地調整植物相關形態等來應對，此前已報道很多miRNA參與調節植物抗病的分子機制研究[5]，如受到引起番茄細菌性葉斑病(Pseudomonas syringaepv.tomato)的病原菌DC3000侵染時，抑制生長素信號，部分由miR393介導的，可能特別促進對強致病菌DC3000的抗性，但與小種特異性抗性無關[6]。在擬南芥中，miR398受到蔗糖的正調控，導致CSD1和CSD2的mRNA和蛋白質的積累減少，由于CSD酶調節ROS，miR398的一個作用可能是影響ROS信號的傳導或衰減，在植株遭受氧化脅迫中起著至關重要的作用[7]。已有研究表明，Pst DC3000（avrRpml或avrRpt2）病原菌侵染模式植物擬南芥時，miRNA398通過改變CSD表達水平來提高植物應對生物脅迫威脅時的抗性[8]。植物miRNAs的一個子集（miR482/2118超家族）可以針對NB-LRR基因調節植物免疫，在番茄中miR482/2118通過NBS-LRR來抵抗番茄晚疫病菌的侵染[9-12]。而在馬鈴薯中，miR160通過靶向StARF10，影響防御和生長路徑的平衡，這可能是馬鈴薯植物在疫霉病菌感染過程中調節局部和SAR防御反應的途徑之一[13]。在水稻中Osa-miR398b通過多種超氧化物歧化酶促進H2O2的產生，從而提高水稻對稻瘟病菌的抗性[14]。同樣，水稻中OsamiR1873通過LOC_Os05g01790微調水稻免疫生長平衡，阻斷Osa-miR1873可以提高稻瘟病抗性，并且產量不受其顯著影響[15]。

因為復雜的致病性，對果樹抗病機制仍缺乏深入了解，miRNA調控果樹抗病的相關分子機制尚不清楚，對抗病基因資源也缺乏全面的掌握和了解。本研究擬以威脅蘋果屬植物生長發育的重要病原菌膠胞炭疽為研究對象，測定病原菌侵染后蘋果屬植物中抗性相關miRNA的表達量變化，研究miRNA在抗炭疽病中所起到的作用，旨在揭示蘋果屬植物炭疽病抗性的分子調控機制提供新的思路，為蘋果屬植物的抗炭疽病尋找新的突破口。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料‘八棱脆’海棠和‘嘎啦’蘋果組培苗由實驗室繼代培養保存。

1.1.2 炭疽病菌株 2019年10月10日在北京市順義區木林鎮資源圃采集發病植株，取樣并進行病原菌分離與鑒定。膠胞炭疽病菌在PDA培養基（土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，煮軟后8層紗布過濾定容至1000 mL，高壓滅菌鍋115℃20 min）上培養。制備膠胞炭疽病菌孢子懸浮液侵染‘八棱脆’海棠和‘嘎啦’蘋果組培苗，4天后發病取樣，在液氮中速凍，-80℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 膠胞炭疽孢子懸浮液制備 將純化鑒定過的膠胞炭疽菌株接種于PDA平板上，在28℃恒溫箱中培養7天，PDA平板上加入適量無菌水用無菌的玻璃涂布刮取表面菌絲，無菌3層紗布過濾制備分生孢子懸浮液。膠胞炭疽菌孢子懸浮液濃度為1×106個孢子/mL，無菌水為空白對照。

1.2.2 接種處理與取樣 試驗設‘八棱脆’（抗性品種）空白對照、‘八棱脆’接種處理、‘嘎啦’（感病品種）空白對照、‘嘎啦’接種4個處理，每個處理3瓶組培苗，試驗設3組重復。用噴壺將106個孢子/mL膠胞炭疽孢子懸浮液均勻噴灑到整個幼苗上，直至滴水狀態，噴施等量無菌水的組培苗作為空白對照。接種4天后發病，發病葉片取樣后立即在液氮中冷凍并保存于-80℃冰箱。計算病情指數[式(1)]，0級，無病斑；1級，病斑面積≤5%；3級，5%＜病斑面積≤10%；5級，10%＜病斑面積≤25%；7級，25%＜病斑面積≤50%；9級，病斑面積＞50%。

1.2.3 植物總RNA提取及反轉miRNA采用復雜植物多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒提取植物葉片總RNA，用全式金試劑反轉miRNA。

1.2.4 實時熒光定量PCR按照SYBR染料法試劑說明書進行實時熒光定量PCR檢測，miRNA以U6作為參照基因，兩步法程序運行，所有樣品取樣均為3次生物學重復，3次技術重復，所用熒光引物見表1。

表1 試驗中所用引物

1.2.5 相關miRNA靶基因預測 通過靶基因預測網站psRNATarget對相關miRNA的靶基因進行預測，通過NCBI比對，找到該基因的詳細描述。

2 結果與分析

2.1 接種后蘋果屬植物發病情況調查

接種膠胞炭疽（圖1）孢子懸浮液4天，調查其發病情況，抗性品種‘八棱脆’葉片只有少數病斑病害，病情指數15.4，病葉率27.6%；而感病品種‘嘎啦’則出現大量病斑且植株萎蔫，病情指數39.3，病葉率71.3%（圖2）。

圖1 菌株形態學培養特征

圖2 蘋果屬植物接種膠胞炭疽菌后發病情況

2.2 抗病相關的miRNA篩選結果

根據實驗室前期工作及相關文獻報道，選出18個抗性相關miRNA候選待測，測定其在膠胞炭疽孢子懸浮液侵染后相關表達量變化。結果（圖3）顯示，在抗性品種‘ 八 棱 脆 ’中 miR390a、miR393a、miR396b/c/f、miR156a/p/t和miR171i下調表達，僅有miR172d和un3729上調表達，其余無顯著變化。感病品種‘嘎啦’中miR390a、miR396b/c/f的表達量是上調的，miR160a、miR482b、miR156a/aa/ad/t和miR171i是下調的，其余無顯著變化。

圖3 蘋果屬植物接種膠胞炭疽菌后相關miRNA表達量

2.3 相關miRNA的靶基因預測

miRNA可導致靶mRNA的降解或者阻遏mRNA的翻譯，從而抑制蛋白質的合成，達到調控基因的目的，因此靶基因的預測研究是探究miRNA功能的重要方式。通過靶基因預測網站psRNATarger(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)對相關miRNA的靶基因進行預測，篩選并得到高度互補且假陽性低的靶基因（表2）。分析相關miRNA和其預測靶基因互補關系得到圖4。miR390a靶基因多為LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mi482b靶基因多為抗性蛋白，miR396b/c/f靶基因多為GRF家族和LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，均與抗性相關。

圖4 相關miRNA及其靶基因互補性分析

表2 相關靶基因預測

3 討論

與動物相似，植物依靠細胞表面和細胞內的免疫受體來抵御病原體。植物先天免疫的第一道防線是通過細胞表面局部模式識別受體(PRRs)識別高度保守的微生物/病原體相關分子模式(MAMPs/PAMPs)，如細菌鞭毛蛋白或真菌幾丁質，從而引發PAMP觸發的免疫(PTI)，限制病原體的生長[15-16]。高度進化的病原體傳遞效應蛋白干擾PTI反應[17]。相應的，植物已經進化出細胞內核苷酸結合域富亮氨酸重復(NLR)類受體，識別病原體效應物并激活效應物觸發免疫(ETI)[18-20]。NBS-LRR蛋白是一類己知的最大的R蛋白家族。近年來，關于miRNA響應非生物脅迫（如抗寒、干旱、重金屬、抗鹽等）的研究報道較多，而關于抵抗病原菌侵染及抗病相關研究相對較少。已有研究表明，miRNA參與了多種和抗病相關的基因表達，例如MdmiRLn11，尤其在病原菌感染條件下調控MdNBS基因的表達，并且MdmiRLn11靶向P-loop位點可能在木本植物中調控許多NBS LRR蛋白類基因[21]。同樣在蘋果中，MdmiRln20通過抑制MdTN1-GLS的表達負調控對GLS的抗性，并首次證明了miRNA在蘋果對GLS的響應中發揮了關鍵作用[22]。楊樹ptc-miR472a通過靶向NBS-LRR轉錄本，在植物對C.gloeosporioides和C.chrysosperma的免疫中發揮關鍵作用[23]。病毒誘導的miR390靶標基因沉默(VIGS)增加了棉花植物生長素和茉莉酸(JA)的積累，從而增加了對白粉虱侵襲的耐受性[24]。番茄中miR396通過抑制水楊酸和茉莉酸信號的防御相關基因，負調控番茄對晚疫病菌和灰霉菌侵染的耐受性[25]。試驗初步鑒定了3個響應蘋果屬植物膠胞炭疽炭疽病菌侵染相關的miRNA，分別是miR390a、miR482b和miR396b/c/f，在抗性品種中miR390a和miR396b/c/f表達量下調，而在感病品種中表達量上調，且其靶基因均有LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白，miR482b靶基因為抗性蛋白，初步認定可能在蘋果屬植物炭疽病的侵染中起著重要作用，然而更加明確的分子作用機理還需要進一步研究驗證。在研究植物miRNA在響應生物脅迫或非生物脅迫的功能過程中，靶基因是至關重要的。目前主要通過預測軟件進行初步預測篩選，后續還應進行5’RACE實驗，對切割位點進行確認，進而發現miRNA和其真實靶基因的網絡調控關系，深入研究其作用機制。