黃龍疫苗(HB-1)對番茄苗期生理特性和病害防治效果的初步研究

李旭銳，胡雪芳，孫 昊，裴海生，鄧中賢，曹勁霞，王士奎

（1農業農村部規劃設計研究院，北京100125；2農業農村部農產品產后處理重點實驗室，北京100121；3遼寧省老教授協會科學技術委員會，沈陽110000；4云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣農業農村局，云南西雙版納666100）

0 引言

番茄(Lycopersicon esculentum)栽培面積廣且營養豐富，是人們生活中重要的果蔬之一，種植番茄已成為農業增效和農民增收的重要途徑。在番茄生產過程中，病毒病和早疫病是2種主要病害[1]，其中病毒病是僅次于真菌病害的主要番茄病害，在世界范圍內廣泛發生，目前已發現可危害番茄的病毒不少于24種[2-4]，如黃瓜花葉病毒、番茄斑萎病毒、番茄叢矮病毒、番茄曲葉病毒、番茄曲葉病毒[5-7]，其癥狀多樣，一般將其分為花葉型、蕨葉型和壞死條斑型3類[8]，其中番茄受到條斑型病毒危害的影響最大，感病后會導致植株表面形成病斑，直至病株萎黃枯死，果實畸形，果面有不規則褐色壞死斑[9]。早疫病在番茄植株的整個生長發育階段均可侵染番茄，發病時會形成病斑，病斑連結使得葉片逐漸干枯，嚴重時植株莖部易折斷，在病害后期會導致果實開裂、形成黑色硬度較高的霉層[10-11]。為解決番茄生產中農藥殘毒和病原菌抗藥性的問題，在化學防治方面，已研制出多種有效的殺菌劑[12]。然而高效、低毒、低殘留的新生物農藥的研制具有廣闊的前景。

碘在農業生產中具有巨大的潛力，碘原子的強氧化性可使其在低濃度下對病毒性、細菌性和真菌性病害產生強烈的抑制和滅活作用[13-14]。碘作為農用殺菌劑，主要以 I2、HOI、OI-、I3-、I-、IO3-等形式存在，其中 I2、HOI被認為在消毒及殺菌作用中發揮重要作用，I-和IO3-是植物吸收碘的主要形式[15-16]。碘可從多種途徑與病原體發生反應的，例如通過與羥基、氨基、烴基、巰基作用而影響微生物的存活[17-18]；碘還可以破壞不飽和脂肪酸分子中的碳雙鍵，改變不飽和脂肪酸的物理性質和化學性質，從而產生不可逆的殺菌特性[19]。但是由于碘的易揮發性、光不穩定性和持效性較差的特點，不能保持長久的藥效，導致它在消毒及農藥中的應用受到很大的限制。黃龍疫苗(HB-1)是農業農村部規劃設計研究院在發明光熱穩定的納米態碘元素制備技術的基礎上，結合碘元素在不同濃度下的植物誘導抗病功能和對致病菌的快速殺滅功能，開發研究出的針對植物專一性寄生性病害（病毒病、黃龍病等）具有獨特的雙功能誘殺制劑[20]。通過新型的流體碘及相變碘材料光熱穩定的性質，徹底解決了碘作為殺菌材料的不穩定性問題，并表現出一定濃度下的生物調節及誘導抗病功能。

本研究通過室內生物活性測定試驗及田間藥效試驗，研究不同濃度HB-1對番茄抗病性及病毒病、早疫病的防治效果，以期為防治番茄病毒病尋找一條新的有效途徑，同時為HB-1防治其他農作物的寄生病害提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄品種為‘晚夏番茄516’。試驗藥劑包括黃龍疫苗(HB-1)（農業農村部規劃設計研究院研制）、過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒（Solarbio公司產品，型號BC0025）、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒（Solarbio公司產品，型號BC0090）。

1.2 試驗設計

1.2.1 室內試驗 室內試驗于2019年11月20日在農業農村部農產品產后處理重點實驗室內進行，對番茄幼苗的抗氧化性進行藥效試驗。試驗用容器為口徑10 cm、深10 cm的花盆，每盆裝入等量滅菌營養土。將材料種子置于55℃清水中浸泡5 h，然后放于培養皿中催芽至露白，種植于花盆中，每盆播種3粒，置于光照培養箱中培養，光周期為白天、黑夜各12 h。白天光強為 100 μmol/(m2s)。溫度為 25℃（晝）/20℃（夜）。設置清水為對照(CK)，將HB-1稀釋至500、1000、2000、3000倍4個濃度梯度。待幼苗長至三葉一心時，對幼苗葉片進行定量噴施，每個處理噴施用量為50 mL，5盆重復，每次噴施間隔5天，期間記錄幼苗期表型變化，在第45天對其生物量及生化指標進行測定。

1.2.2 田間試驗 田間試驗于2019年8月18日在沈陽市于洪區馬三家鎮拉馬臺村試驗點的溫室大棚內進行，試驗地面積526 m2，白天溫度為25～30℃，夜間溫度為18～25℃，白天光照強度為850 μmol/(m2·s)。試驗分為番茄病毒病和番茄早疫病調查2個部分，每部分設計4個處理，分別為對照CK（以清水澆根定植和噴施）和處理TR（以HB-1澆根定植和噴施）；秧苗長至四葉一心、株高14 cm時澆根定植，CK和TR分別以清水和本劑800、1500、2500倍液等量澆灌；緩苗后8天進行噴施試驗，分別噴施清水和本劑800、1500、2500倍液，間隔7天再噴施一次，共噴2次，噴藥量以藥液在葉面飽和無下滴為限。10天后（第二穗花開45°角時）進行番茄幼苗發病率統計。每個處理4次重復，隨機區組排列，共32個小區。

每個處理調查取樣150株，計算病情指數和防治效果，結果顯著性檢驗采用新復極差測驗法，顯著水平5%。番茄病毒病分級標準，0級—植株正常，葉片無癥狀；1級—輕花葉，明脈，植株不矮化；3級—花葉明顯，葉片輕度皺縮，植株不矮化；5級—重花葉，葉片皺縮、畸形，植株輕度矮化；7級—重花葉，葉柄、莖部或總花梗有條斑壞死，果實花斑，植株叢縮、矮縮；9級—線葉，莖部嚴重發病至全株壞死[21]。

按分級計算病情指數，然后根據病情指數計算防治效果，如式(1)～(2)。

1.3 樣品測定

待番茄出芽后第45天，進行葉片樣品的采集與制備。每個處理挑選長勢一致的植株3株，用直尺和游標卡尺測量幼苗株高、莖粗、葉片數。隨機摘取健康的真葉，液氮冰浴研磨至粉末，稱取粉末0.1 g于1.5 mL離心管中，加入1 mL磷酸緩沖液，置于冷凍離心機離心10 min，設置轉速8000 r/min，溫度4℃。隨后取上清，置冰上待測。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定，過氧化物酶活性采用愈創木酚法測定[22]。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據統計，SPSS 24軟件Duncan分析方法進行差異顯著性檢驗，Origin 9.0軟件進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 黃龍疫苗(HB-1)對番茄幼苗表型的影響

番茄幼苗在室內光照培養箱內的生長表型觀察結果如圖1～2。與對照相比，經HB-1稀釋500倍液處理后的苗高、莖粗和葉片數無顯著差異(P＜0.05)；稀釋1000、2000、3000倍液處理后，番茄幼苗的苗高、莖粗和葉片數表現出顯著差異(P＜0.05)；其中以稀釋2000倍液處理苗高、莖粗和葉片數均達到峰值，分別比對照高出3.50 cm、1.12 mm、5.33個，表明稀釋2000倍液處理顯著促進了番茄幼苗的生長。

圖1 黃龍疫苗(HB-1)對番茄幼苗表型的影響

圖2 黃龍疫苗(HB-1)對番茄幼苗苗高、莖粗和葉片數的影響

2.2 黃龍疫苗(HB-1)對番茄幼苗過氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響

從圖3中可以看出，與對照相比，葉片中POD活性隨HB-1溶液濃度的減小呈現先升高后降低的趨勢，不同稀釋倍數下，POD活性由大到小分別為2000倍＞1000倍/500倍＞ 3000倍＞CK(P＜0.05)，可見POD活性在稀釋2000倍液下達到6947.92 U/g。葉片中MDA含量恰好呈相反趨勢，其中2000倍液MDA含量最低，為42.32 nmol/g，CK與3000倍液無顯著差異，MDA含量最高，分別為62.29、65.27 nmol/g。結果表明，稀釋2000倍的HB-1溶液對POD活性有顯著促進作用，且POD活性和MDA含量呈負相關關系。反映出稀釋2000倍液的碘元素濃度能夠促使番茄幼苗釋放出更多的POD，有效降低MDA含量。

圖3 黃龍疫苗(HB-1)對番茄幼苗POD活性和MDA含量的影響

2.3 黃龍疫苗(HB-1)對番茄幼苗病毒病及早疫病的田間防治效果

番茄幼苗進行黃龍疫苗(HB-1)噴施處理后的結果如表1所示，清水處理的番茄病毒病和早疫病病疫指數分別為26.62和19.25，顯著高于噴施HB-1處理。與對照相比，稀釋800、1500、2500倍液處理番茄幼苗后，番茄病毒病和早疫病的病疫指數隨HB-1濃度的增加而降低，對病毒病的防治效果分別為96.4%、70.7%、54.9%，對早疫病的防治效果分別為70.3%、57.8%、48.8%，說明施用HB-1可有效防治番茄斑萎、紅莖病毒病和番茄早疫病，其中以稀釋800倍液處理效果最為理想。

表1 黃龍疫苗(HB-1)對番茄病毒病和早疫病病情指數及防治效果的影響

3 結論與討論

番茄病毒病和早疫病在植株的整個生長時期均有發生，在幼苗期做好病害防控對于番茄后期的產量和生長至關重要。結果表明，通過黃龍疫苗(HB-1)處理番茄幼苗，防治效果顯著，達到速效及長效相結合的目的。（1）田間藥效試驗表明，噴施HB-1后的處理藥效明顯，其中HB-1稀釋800倍顯著降低疫病發病，病毒病防治效果可達96.40%，早疫病防治效果可達70.30%；表明在植物可接受濃度范圍內，高濃度HB-1對植物的防病效果最好。由此推斷，通過葉面施肥的方法，植物細胞通過主動運輸的方式吸收納米碘，進入細胞內部后，納米碘粒子通過其強氧化性，對細胞內專一性寄生病菌進行攻擊和氧化，抑制微生物的生長，從而對病害起到治療效果，具體抗病機理還有待進一步研究[23]。（2）對幼苗表型的測定結果表明，相比于對照，以HB-1稀釋液噴施葉片顯著增加了苗高、莖粗和葉片數，尤其以2000倍液效果顯著，相比于其他處理，HB-1稀釋2000倍液的處理植株長勢旺盛，葉色濃綠，苗高、莖高及葉片數均顯著高于其他處理。表明一定濃度范圍內HB-1能夠促進番茄幼苗生物量積累，由此推斷，HB-1中的碘元素發揮了有效作用。前人研究表明，外源碘的施加可影響葉片中葉綠素含量的變化，黑麥草葉片中葉綠素含量隨外源碘濃度的升高先增加后降低[24]。辣椒吸收I-后提高葉片葉綠素含量，且在不同生長期對葉綠素含量存在差異[25]，葉綠素含量的變化影響植物進行光合作用，促進植物對有機碳的積累，從而增加植株的生物量。（3）過氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量與植物表型有密切關系，葉片中較強POD活性以及較低的MDA含量可顯著增加植株苗高、莖粗及葉片數量，具體表現為HB-1稀釋1000、2000、3000倍液顯著提高POD活性，降低MDA含量。稀釋2000倍液處理時葉片中POD活性達到峰值，同時MDA含量達到最低值，此結果與劉會萍等[25]的研究結果一致。究其原因，可能是HB-1中的碘元素清除了部分活性氧，提升了POD的活性，并使植物光合作用增強從而顯著提升植株生物量積累[26]，另一方面，POD活性的提升可降低MDA的產生，降低膜中不飽和脂肪酸的含量，從而緩解細胞膜受傷害程度[27-28]，提高植物抗氧化脅迫性和抗逆性。

本研究通過田間試驗和室內生測，探討施加外源碘對番茄病害和植株的生理響應，結果表明在一定濃度范圍內，HB-1可調節植物生長、誘導植株產生抗病性、滅殺病原菌、提高作物產量、改善作物品質，其中HB-1中的碘元素起了至關重要的作用，具體的機理有待進一步研究。